基于多肽阵列技术探讨芪归银方对多重耐药铜绿假单胞菌感染大鼠的干预作用*

孔令博 李艳鹏 王冬梅 姚新颖 王辉军 杨雪冬刘佳莹 田 莉 孟昭莉 韩 强 刘清泉

（1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.首都医科大学附属北京友谊医院新华医院，北京 101149；3.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010）

近年来，随着超广谱抗生素在临床上的广泛应用，对β-内酰胺酶类和碳青霉烯类抗生素耐药的多重耐药菌株和泛耐药菌株的检出率不断增高［1］。耐药菌株对人类健康的威胁及其所导致的经济成本急剧攀升［2］。以铜绿假单胞菌为例，据2015年至2017年中国细菌耐药性监测（CHINET）数据显示，铜绿假单胞菌中泛耐药株的检出率呈上升趋势，对亚胺培南和美罗培南的耐药形势尤为堪忧［3-5］。由于铜绿假单胞菌耐药机制十分复杂，临床治疗非常棘手［6-8］。基于中药复方具有多途径、多靶点的优势，前期研究以多重耐药铜绿假单胞菌为研究对象，切合耐药菌感染 “正虚邪侵，热毒内伏”的中医病机特点创制了芪归银方，并证实了芪归银方对机体淋巴细胞增殖的干预作用［9-11］。有鉴于此，本实验利用多肽阵列技术从蛋白质组学水平对芪归银方调控多重耐药铜绿假单胞菌感染大鼠免疫功能的作用机制开展了进一步探索。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物 芪归银方（黄芪60 g，金银花15 g，当归15 g，青蒿 10 g，虎杖 10 g）提取物（1.0 g/mL），由北京中医药大学中药学院中药研究室提供；注射用头孢他啶，由深圳致君制药有限公司生产，产品批号E20100102。按照70 kg成人用量的6.3倍计算大鼠的给药剂量。

1.2 实验动物 雄性清洁级SD大鼠36只，体质量200～220 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK（军）2007-004。正常光照条件下，食、水可自由摄取，室温控制在18～22℃之间。

1.3 菌株 多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株1643号，由首都医科大学附属北京朝阳医院细菌室提供。

1.4 试剂与仪器 M-H琼脂平板购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司（批号：XWO1100301），立式自动电热压力蒸汽灭菌器（ASTELL公司，型号：AMA440N），恒温培养箱（SAMYO 公司，型号：SIM-F124），涡混合器 （Scientific Industries公司， 型号：VORTEX-GENIE 2），低温高速离心机（上海爱丁堡生物科技发展有限公司，型号：Kendro Labofuge 400R），微量天平（METTLER公司，型号：AE100），酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司，型号：DNM-9602），AutoSpot peptide synthesizer多肽合成仪（CEM 公司，型号：Liberty Lite），数字成像分析仪 （华瑞同康生物技术有限公司，型号：FX-7）。

1.5 菌悬液制备 将实验菌株接种于M-H琼脂培养基活化，经37℃恒温培养18～24 h后，用生理盐水洗脱菌落，3 000 r/min离心20 min，弃去上清，加入生理盐水，混匀后吸出0.5 mL加入新的无菌试管中，加入适量生理盐水，与比浊计进行比浊，将菌液稀释成24×108CFU/mL，用酶标仪检测 OD 值为（0.675±0.005），再将其稀释成0.48×108CFU/mL，作为实验菌悬液。

1.6 模型制备 SD大鼠常规饲养1周，室温控制在18～22℃之间，自由获取食、水，采血前禁食过夜。按照杨钧等报道的方法建立多重耐药铜绿假单胞菌腹腔感染大鼠模型［12］。具体方法如下：将多重耐药铜绿假单胞菌菌液（以下简称菌液）同2.0%西黄芪胶1∶1混合后，腹腔注射。注射后自由进食、饮水。

1.7 分组与给药 雄性SD大鼠36只，采用随机数字表法分为空白组、模型组、芪归银方组，共3组，每组各12只。模型组腹腔注射菌液后（5 mL/kg），即给予0.9%氯化钠注射液灌胃，每次2 mL，每日1次。扶正透邪方最佳剂量组腹腔注射菌液后（5 mL/kg），即给予扶正透邪方提取物（0.99 g/mL）灌胃，每次2 mL，每日1次。7 d后留取以上各组大鼠血清标本，进行多肽阵列检测。

1.8 检测方法 1）多肽阵列合成。选择铜绿假单胞菌耐药蛋白序列中的金属酶VIM-1（CAG23926）、SPM-1（AAR15341）和超广谱内酰胺酶（TEMs/ESBLs）TEM（ABB76656）3种蛋白质，进行多肽阵列制作。 （1）配置封闭液Ⅰ：选取 2%（v/v）aceticanhydride in DMF。封闭液 Ⅱ ：2% （v/v） acetic anhydride+2% （v/v） DIPEAin DMF，0.3 mol/L Fmoc-氨基酸溶液，去保护溶液［20%（v/v） piperidine in DMF］。 （2）把活化的 PEG-纤维素膜放置在Autospotter上，再根据程序将 30 μL的Fmoc-氨基酸溶液自动移液到活化的PEG-纤维素膜上的特定位置，并与膜进行2次反应、每次20 min。（3）把PEG-纤维素膜按照顺序浸入到封闭液Ⅰ中（反应时间5 min）和封闭液Ⅱ中（反应时间20 min），之后进行侧链封闭，再进行DMF清洗4次，每次30 s。（4）加入去保护溶液中，2次，每次5 min，用于移除氨基端的Fmoc保护基团。（5）在去保护之后，用DMF清洗3次，每次30 s，然后用乙醇干燥。（6）完成全部合成后，用TFAcocktail将侧链保护基团去除，再用CH2Cl2清洗4次，然后用乙醇干燥，-20℃保存，用于下一步免疫反应实验。每张多肽阵列横向为12个多肽点，纵向为8个多肽点。2）多肽阵列与血清免疫反应。（1）封闭：4%skim milk+5%sucrose in TBST buffer， 室温 4 h。（2）一抗孵育：对血清进行1∶200稀释；然后与多肽阵列反应，在4℃下过夜。（3）洗膜：用TBST buffer进行漂洗，漂洗 3次、每次 10 min。 （4）二抗孵育：二抗（羊抗人）IgG-HRP， 用封闭液进行 1∶1 000 或 1∶2 000 稀释，在室温下放置2 h。（5）洗膜：用TBST buffer漂洗，漂洗3次、每次10 min。（6）显色：加入ECL发光试剂，进行数字成像。

1.9 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较用单因素方差分析和t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清对VIM-1蛋白的影响比较 见表1，图1。空白组大鼠血清对耐药蛋白VIM-1的重叠多肽片段产生不同程度的抗体反应，而铜绿假单胞菌感染后，血清抗体反应的明显变化表明，上表中多肽片段指征的耐药蛋白VIM-1的抗原决定簇能够激发大鼠的免疫反应。芪归银方组大鼠中，针对表位7-11和36-40的抗体表达强度大于空白和模型组的抗体表达强度（均P＜0.05）；模型组中，针对53-54和56-58表位的抗体反应强度降低（均P＜0.05），而芪归银方组的抗体反应虽较正常组为低，但高于模型组大鼠 （P＜0.05）；与空白组比较，模型组和芪归银方组大鼠均产生针对23-25表位的较强抗体反应，两者之间比较差别不大（P＞0.05）；而模型组对80-81表位产生显著的抗体反应，但在空白组和芪归银方组中则无明显反应（均P＞0.05）。

表1 各组大鼠血清对VIM-1的抗体表达比较（n）

图1 各组大鼠血清对VIM-1的抗体表达差异

2.2 各组大鼠血清对SPM-1蛋白的影响比较 见表2，图2。空白组大鼠血清对耐药蛋白SPM-1的重叠多肽片段产生不同程度的抗体反应，不相关抗体产生的非特异性反应可能是其中部分原因，针对25-28、61-64和73-76抗原决定簇的抗体反应最有可能是这一原因造成的，但各组间差别不大（均P＞0.05）。感染刺激大鼠产生新的更多地针对13-15和39-40表位的抗体，然而，相较于空白组和芪归银方组产生的针对16-19和82-85抗原的免疫反应，模型组大鼠则产生的抗体反应更弱（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清对SPM-1的抗体表达比较（n）

图2 各组大鼠血清对SPM-1的抗体表达差异

2.3 各组大鼠血清对TEM-1蛋白的影响比较 见表3，图3。铜绿假单胞菌感染后刺激大鼠免疫系统并且产生更强的针对多肽 19-21、26-27、52-55和66-70的反应，且这些多肽可被认为是特异性的抗原决定簇。各组大鼠血清中抗体针对的阳性表位数目差别不大（均P＞0.05）；芪归银方组对TEM-1蛋白19-21和52-55表位的抗体反应强于模型组和空白组 （均P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清对TEM-1的抗体表达比较（n）

图3 各组大鼠血清对TEM-1的抗体表达差异

3 讨 论

多肽阵列技术是一种高通量蛋白质组研究工具，能用多肽模拟蛋白抗原与自身抗体结合，被认为是后基因组时代与基因芯片、蛋白芯片相媲美的新型蛋白位点检测技术。现已被广泛应用于药物筛选、靶标确认、表位定位以及蛋白结构功能和相互作用等研究，应用前景广阔［13-16］。本实验首次将多肽阵列技术引入到探索中药复方对耐药菌感染作用机制的研究中。检测结果显示，与空白和模型相比较，芪归银方组大鼠在金属酶蛋白VIM-1针对7-11和36-40表位的抗体反应明显增强，这说明中药治疗能够刺激淋巴细胞产生针对这些表位的抗体。同时，针对表位7-11和36-40的抗体可能通过中和VIM-1耐药蛋白诱发有益的效应，并对大鼠机体产生保护作用。而对于金属酶SPM-1而言，在铜绿假单胞菌感染后针对13-15和39-40表位出现更强的抗体反应，表明感染刺激免疫系统产生特异性抗体，但芪归银方治疗并没有对上述抗体反应产生可辨别的变化，表明对这些特异性抗体可能没有产生影响。而对于TEM-1蛋白，芪归银方组较模型组大鼠血清针对26-27、52-55和66-70的抗体反应增强，表明芪归银方可能通过刺激这些特异性抗体的产生而发挥其对感染后大鼠更佳的保护作用。上述结果与前期相关研究具有较好的一致性，相互印证了芪归银方能够通过调节机体免疫应答反应，纠正耐药菌感染后导致的免疫紊乱，具提高抗多重耐药菌感染临床疗效的潜力与优势，值得进一步深入研究。