嗜酸乳杆菌对小鼠溃疡性结肠炎模型的保护机制研究*

任 聪，陈向东，汪 辉，鲍张杰，练家惠

中国药科大学 生命科学与技术学院，南京 210009

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病的一种，溃疡性结肠炎的发病原因尚不明确，可能与遗传、环境、免疫紊乱和肠道菌群失调等因素有关。临床对于溃疡性结肠炎主要应用以柳氮磺胺吡啶为代表的氨基水杨酸类药物作为主要的治疗药物[1]，对大部分轻、中度患者可收获较好的疗效，但对部分患者，特别是长期服药的患者存在易复发和副作用大等缺陷[2]，且长期服药价格较高。因此，寻找廉价且副作用小的新疗法成为近年来医药学界的研究热点。

近年来益生菌在UC治疗中越来越受到人们的关注[3]。本课题组先前对多株益生菌进行耐酸和耐胆盐抗性筛选，得到一株抗性最佳的嗜酸乳杆菌作为试验菌株。本研究旨在通过探究嗜酸乳杆菌对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎的保护作用及其作用机制，为临床应用嗜酸乳杆菌治疗和缓解溃疡性结肠炎提供依据。

1 材 料

1.1 实验动物和菌株

健康SPF级ICR小鼠40只，雌雄各半，体质量（18~20）g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，合格证编号：201728275，饲养于中国药科大学动物实验中心。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）由中国药科大学微生物学教研室提供。

1.2 药品与试剂

MRS培养基（北京奥博星生物科技有限公司）；RNAiso Plus、2×PrimeSTAR Max Premix（Takara）；5×All-In-One MasterMix（南京爱必梦生物材料有限公司）；2×UltraSYBR Mixture（康为世纪生物科技有限公司）；柳氮磺胺吡啶（上海信谊天平药业）；葡聚糖硫酸钠（MP Biomedicals）；重蒸水自制。

1.3 仪器

CFX96 real-time PCR仪、S1000TM Thermal Cycler PCR仪（美国伯乐有限公司）。

2 方 法

2.1 DSS诱导小鼠UC建模和给药

将40只SPF级ICR小鼠随机分为4组，每组10只，分别为模型组、阳性药组、菌液组和空白组。

模型组、阳性药组和菌液组均使用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）造模，方法为以自由饮用的方式给予小鼠质量分数3%的DSS水溶液，时长为7天，致造模成功。

模型组小鼠灌胃生理盐水，灌胃体积为0.5mL·d-1；菌液组小鼠灌胃嗜酸乳杆菌菌液，菌浓度为1×108CFU·mL-1，体积为 0.5 mL·d-1；阳性药组小鼠灌胃柳氮磺胺吡啶，将柳氮磺胺吡啶溶于生理盐水，配制成 20mg·mL-1溶液，依体重给药，终剂量为500mg·kg-1，时长为7天。空白组小鼠仍正常饲养。

2.2 溃疡性结肠炎症状评估

每日称量各组小鼠体重，并观察小鼠的活动情况、外观变化、饮食情况、粪便性状和便血情况，参照Liu W等[4]的方法，对小鼠进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分，标准为：①体重减轻（0，无减轻；1，减轻 1%～5%；2，减轻 6%～10%；3，减轻 10%～20%；4，减轻超过 20%）。②腹泻（0，正常；2，稀便；4，水样腹泻）。③便血（0，无出血；2，轻微出血；4，大出血）。实验第8天采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖小鼠后取出结肠段，在冷PBS溶液中清洗后测量结肠长度。用剪刀剪取3～5 mm的结肠段落，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，进行石蜡包埋后切片，厚4μm，HE染色，显微镜下观察。

2.3 免疫组化法检测结肠组织p-STAT3和IL-6表达

将结肠组织的石蜡切片在恒温烘箱中于60℃下干燥1 h，在0.01 mol·L-1PBS溶液洗涤3次，每次5 min，用无水乙醇洗涤10 min，重蒸水洗涤两次。将石蜡切片置于微波炉中，100℃保持8 min以进行抗原修复。过氧化氢（3%）用于抑制内源性过氧化物酶活性，封闭溶液用于阻断非特异性抗原。将切片与抗p-STAT3和IL-6抗体在4℃下孵育过夜，然后与第二抗体孵育后进行DAB染色。最后，将切片脱水、固定，在显微镜下观察。

2.4 qRT-PCR检测miR-214相关基因表达量

取小鼠结肠组织在无核酶条件下匀浆，加TRIZOL提取总RNA后进行逆转录反应制备cDNA，需在冰面上避光操作。以GAPDH为内参基因，利用Ultra SYBR Mixture试剂盒进行qRT-PCR。引物序列见表1。反应体系为20μL。基因的表达水平倍数用相对定量法，即2-ΔΔCt法计算。计算公式如下：

Ct2′为待测组目的基因平均Ct值；Ct1′为待测组内参基因平均Ct值；Ct2为对照组目的基因平均Ct值；Ct1对照组内参基因平均Ct值。

表1 qRT-PCR引物序列

2.5 统计学分析

采用统计学软件GraphPad Prism5和SPSS19.0处理实验数据，组间比较进行t检验。P＜0.05有显著性差异。

3 结 果

3.1 溃疡性结肠炎症状评估

在各组小鼠中，模型组小鼠体重严重下降，萎靡不振，毛发无光泽，实验第3天出现粪便稀软、不成形，粘附于肛门周围，第6天出现血便，证明造模成功。阳性药组和菌液组小鼠各项症状均有明显好转，未出现严重血便。空白组体重稳步增长，各项体征正常。

由图1可见，模型组小鼠体重较空白组显著下降（P＜0.01），阳性药组和菌液组小鼠体重下降程度较模型组显著减小（P＜0.05）。

由图2可见，模型组小鼠DAI评分较空白组显著增加（P＜0.01），而阳性药组和菌液组小鼠DAI评分较模型组显著降低（P＜0.01）。以上结果表明，嗜酸乳杆菌对DSS诱导小鼠UC有明显的缓解作用。

由图3可见，模型组小鼠结肠长度较空白组明显缩短（P＜0.01），说明模型组小鼠有严重的溃疡性结肠炎症状，而阳性药组和菌液组小鼠结肠长度较模型组显著增加（P＜0.01）。

图1 4组体重变化曲线（n=10）

图2 4组DAI评分（n=10）

图3 4组结肠拍照的长度比较（n=10）

3.2 结肠组织病理学变化

结肠组织HE染色观察发现，由图4可见空白组（A）小鼠结肠壁清晰，上皮完整，腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞丰富，无炎细胞浸润。模型组（B）小鼠结肠上皮坏死脱落，肠壁变薄，腺体凌乱，溃疡症状严重，黏膜肌层出现大量炎细胞浸润。阳性药组（C）和菌液组（D）小鼠结肠上皮溃疡症状有明显改善，无严重溃疡症状。

图4 4组结肠组织HE染色观察（200×）

3.3 结肠组织IL-6、p-STAT3蛋白表达结果

通过免疫组化法对比IL-6、p-STAT3在各组小鼠结肠组织中的表达情况。由图5可见，与空白组相比，在模型组中，IL-6和p-STAT3表达呈强阳性。与模型组相比，阳性药组和菌液组表达呈弱阳性。

3.4 miR-214通路相关基因表达结果

qRT-PCR检测结果如图6所示，与空白组比较，模型组 miR-214、IL-6、TNF-α 基因表达量明显提高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组和菌液组miR-214、IL-6、TNF-α 表达量显著降低 （P＜0.01）。与空白组比较，模型组PTEN、PDLIM2基因表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组和菌液组PTEN、PDLIM2 基因表达显著提高（P＜0.01）。

4 讨 论

本研究结果显示，模型组小鼠较空白组小鼠存在明显的溃疡性结肠炎症状，阳性药组和菌液组小鼠体重变化等各项症状均显著改善，结肠组织完整程度较好，已接近空白组。此前研究证明，益生菌具有免疫调节功能，改善黏膜上皮屏障功能和竞争性抑制致病菌在肠上皮的定植等[5，6]。因为益生菌需经胃后定植于肠道起作用，所以其对胃酸和胆盐的抗性对发挥益生作用至关重要。本实验采用筛选出的一株耐酸耐胆盐抗性较好的嗜酸乳杆菌作为试验菌株，研究结果表明，嗜酸乳杆菌能够对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎有较好的保护作用。

图5 免疫组化法检测4组小鼠结肠IL-6和p-STAT3表达（100×）

图6 4组qRT-PCR检测结果（n=10）

溃疡性结肠炎发病机制复杂，其中炎症是重要原因，p-STAT3是一个标志性的炎症因子，磷酸化程度越高，则炎症越明显，IL-6可促进p-STAT3磷酸化[7]。本研究通过免疫组化法测定小鼠结肠组织中IL-6和p-STAT3的表达，结果显示，模型组表达水平最高，表明模型组产生严重的炎症反应，而阳性药组和菌液组表达显著减少，说明此两组炎症反应较模型组轻。Farraye FA等[8]研究证明，UC患者机体内miR-214的表达与UC发病程度呈显著正相关。miR-214表达上调可抑制PTEN和PDLIM2的表达，进而使核转录因子kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）表达升高，导致下游促炎症因子如IL-6、TNF-α等表达。本实验qRT-PCR检测结果显示，模型组miR-214表达较空白组显著上调，而PTEN和PDLIM2的表达则降低，炎症因子IL-6、TNF-α表达升高，表明模型组miR-214及下游通路发生紊乱。而阳性药组和菌液组则通过下调miR-214表达，解除其对PTEN和PDLIM2的抑制，改善了该通路紊乱的情况，最终使促炎因子IL-6、TNF-α表达降低，从而改善了炎症反应。

综上所述，本研究证明，嗜酸乳杆菌对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有较好的保护作用，并进一步证明其作用机制是通过下调miR-214，从而改善下游通路紊乱，最终改善炎症反应，为使用嗜酸乳杆菌进行溃疡性结肠炎的临床治疗提供了依据。