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太子参环肽提取物对LQIS-COPD大鼠动物模型的干预作用

2019-06-27杨晗阚永军曾洁

中国民族民间医药·上半月 2019年1期
关键词:太子参

杨晗 阚永军 曾洁

【摘要】目的:考察太子参环肽提取物对肺气虚证慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的干预作用。方法:采用烟熏+木瓜酶蛋白制备肺气虚证慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydiseaseoflung-qiinsufficiencysyndrome,LQIS-COPD)大鼠模型,太子参环肽提取物高、中、低剂量(100mg/kg/d、200mg/kg/d、400mg/kg/d),灌胃给药30d;测定大鼠的气道阻力和肺动态顺应性。结果:LQIS-COPD大鼠给予太子参环肽提取物治疗后,咳嗽、气急、喘鸣的症状明显改善,显著降低模型大鼠的肺气道阻力,增加其肺动态顺应性。结论:太子参环肽提取物对LQIS-COPD有良好的干预作用。

【关键词】太子参;环肽提取物;LQIS-COPD;干预作用

【中图分类号】R285.5【文献标志码】A【文章编号】1007-8517(2019)1-0025-03

慢性阻塞性肺疾病(ChronicObstructivePulmonanyDisease,COPD),是以气道不完全可逆性气流受限为特征的疾病,与肺部对香烟、雾霾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关[1]。COPD属于中医“喘证”、“肺胀”等范畴。病情长期反复于缓解和急性发作之间,日益加重。中医药防治有悠久历史,各医家多以祛邪和补虚相结合的方法治疗。急则治标,急性发作期多以祛邪为主;缓则治本,稳定期补虚,或攻补兼施。无论是在COPD急性期还是稳定期,不仅止咳化痰平喘,还进行全身整体调节,中医药或中西医结合均有着很好的疗效,且副作用小[2-3]。

肺气虚是COPD的始动因素,并贯穿于整个病程。对气虚的治疗是COPD稳定期的重要中医治疗策略[4];肺气虚的改善,可以有效减轻症状和减缓肺功能下降趋势,对于多发、难治、具有反复发作特点的肺系疾病的综合防治有积极作用[5]。太子参为石竹科植物孩儿参(Pseudostellariaheterophylla(Miq.)PaxexPaxetHoffm.)的块根。既能益气,又可养阴,适用于脾肺亏虚气阴不足者。以清补润燥见长,在中医治疗慢性呼吸系统疾病中,为治疗肺气虚的核心药物,使用频次很高[6]。

太子参中所含化学成分种类繁多。其中,太子参环肽是由十多个氨基酸脱水缩合形成的环状化合物,不仅具有能够形成限制性构像的特点,而且其抗化学降解和抗酶解的能力在生物体内也强于线性肽,是一类有特色化学结构的成分[7],但活性并不明确。制备液相色谱能够实现在线检测,具有高效分离的特点,其自动化的程度比较高,操作简单,所得产品纯度较高,在中药制备分离方面得到了广泛的应用[8]。本文利用制备型高效液相制备分离环肽提取物,从肺气虚证(Lung-qiInsufficiencySyndrome,LQIS)入手,探讨太子参环肽提取物对COPD的干预作用,以活性为导向,发现太子参中药效物质。

1仪器与材料

1.1仪器ShimazuLC-8A型制备液相色谱仪(Japan),Waterse2695液相色谱仪,HypersilBDSC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱、C18制备型液相色谱柱;Medlab生理信号采集处理系统(南京美易有限公司),超声雾化器(广东粤华医疗器械有限公司),生理体积描记盒(南京美易科技有限公司),呼吸流量计(北京新航兴业科贸有限公司);MOKULYOD-230型冷冻干燥器;BARNSTEADTⅡ型超纯水机(美国Thermo公司)。

1.2材料太子参[Pseudostellariaheterophylla(Miq.)PaxexPaxetHoffm.],购于福建柘参种业有限公司,经检验符合药典标准。

SPF级Wistar大鼠,雌雄各半,体重(200±20)g,上海斯莱克实验动物有限公司出品。

色谱纯试剂:甲醇(德国Merck公司),乙腈(美国Fisher公司);分析纯试剂均为国药集团化学试剂有限公司出品,水为电阻率为18.2Ω的超纯水。

2方法结果

2.1太子参环肽提取物制备称取干燥一定重量的太子参药材粉碎至20目,以10倍乙酸乙酯为溶剂,采用索氏提取法提取2次,每次3h,过滤合并滤液,于旋转蒸发仪上减压回收乙酸乙酯,获得干浸膏。取太子参乙酸乙酯干浸膏,以甲醇溶解,按本项目组专利方法进行高压制备色谱环肽提取物分离,采用制备型液相色谱柱、采用紫外检测器,检测波长为205nm;以乙腈—磷酸溶液进行梯度洗脱,自动馏分收集器收集馏分[9]。按如下方法检视提取物特征。

2.2环肽的检识

2.2.1薄层鉴别按文献方法[10],取两块25mm×50mm的硅胶板G(板1和板2),将样品分别点在两块板上,用氯仿-甲醇(9∶[KG-*3/5]1)展开挥掉溶剂后,板1放置,而板2悬于底部加有约1mL浓盐酸的密闭的磨口玻璃缸中(耐酸和耐高温玻璃缸),置于已升温至110℃的烘箱中,加热水解1~2h,冷却后取出板2,在通风柜中挥掉盐酸然后将未经水解的板1和加热酸水解的板2同时喷洒0.2%茚三酮丙酮试剂,用电吹风加热几分钟即可显色。用上述方法重复操作一次,根据两次实验结果,板2在多数情况下显示几个紫红色斑点,少数情况下显示某些黄色斑点,而板1在相应位置上无显色斑点,由此提示样品含有环肽或肽酰胺成分。

取50mm×50mm硅胶G板(板3),按照双向薄層层析板点样方法将样品点在板上,用氯仿-甲醇(9∶[KG-*3/5]1)作第一向展开挥掉溶剂后,先按前述方法浓盐酸高温水解冷却挥掉盐酸后,然后在溶剂系统A(氯仿-甲醇-冰醋酸,8∶2∶2滴)进行第二向展开。挥掉溶剂后,板3喷洒0.2%茚三酮丙酮试剂,用电吹风加热几分钟斑点即显出,按照上述方法再重复操作一次,板3在第二向的同一轴上显示多个紫红色或黄色斑点,确定样品中含有环肽成分。

2.2.2代表性环肽波谱数据太子参环肽A,[M+H]+m/z728.4346,分子式C37H57N7O8,摩尔质量727.4269,二级质谱(MS/MS)特征碎片离子m/z分别为728.4354、710.4245、610.2519、310.2149、197.1280;太子参环肽B,[M+H]+m/z779.4434,分子摩尔质量778.4378,分子式C40H58N8O8,二级质谱(MS/MS)特征碎片离子m/z分别为779.4467、751.4508、405.2494。

2.3药理学实验

2.3.1动物造模本实验采用《中医实验动物学》之“肺气虚证”动物模型制备方法,并复合木瓜蛋白酶雾化吸入,复制“LQIS-COPD”模型大鼠。正常组(空白对照)置于正常无烟环境中饲养;大鼠暴露于1m3烟室中,用刨花/锯末30g,香烟每支燃约10min,连续3支;另加SO2粉10g,点燃烟熏;每日2次,每次1h,并于造模开始后第30、32、34、36天将超声波雾化器与40cm×40cm×40cm透明塑料箱相连,通过雾化管向箱中模型大鼠喷入0.3%的木瓜蛋白酶,每5只大鼠2mL,造模期60d。

2.3.2分组给药Wistar大鼠随机分组,每组10只。空白对照组、模型对照组造模结束后开始用生理盐水灌胃10mL/kg·d,同时雾化吸入生理盐水4mL/d;阳性对照组,灌服桂龙咳喘胶囊:每天用药剂量1.25mL/100g,以含生药0.09g/mL的药液灌服;治疗组,太子参环肽提取物高、中、低剂量(100mg/kg/d、200mg/kg/d、400mg/kg/d),灌胃给药模型大鼠30d。

2.3.3统计分析采用SPSS15.0软件,数据以均值(x±s)的形式表示,二组间的比较用t检验,二个以上组间的比较用ANOVA/Holm-Sidak统计软件处理。以P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有高度统计学意义。

2.4实验结果

2.4.1模型大鼠一般状况大鼠出现咳嗽、气急、喘鸣、精神萎靡、行动迟缓、蜷伏不动、毛失光泽等症状,检测一秒用力呼气容积(FEV1)和用力呼气量(FEV),FEV1/FVC<70%、30%

2.4.2大鼠肺功能测试灌胃给药结束第2天,以25%乌拉坦(4mL/kg相当于1000mg/kg)将大鼠麻醉后,切开颈部皮肤,分离气管,行气管插管。压力换能器、呼吸流量计连接Medlab生物信号系统测出潮气量、气道流速、跨肺压,经数据处理得到肺气道阻力(RL)和动态肺顺应性(Cdyn)。LQIS-COPD大鼠给予太子参环肽提取物治疗后,实验结果见表1。

3结论

LQIS-COPD大鼠给予太子参环肽提取物治疗后,LQIS-COPD大鼠咳嗽、气急、喘鸣的症状明显改善。

模型组大鼠RL较空白对照组增加了40.10%,而Cdyn则下降了75.14%;桂龙咳喘胶囊阳性对照组,较模型组RL下降了25.99%,Cdyn增加了140.40%。太子参环肽提取物400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg低、中、高剂量组,RL分别下降了24.01%、25.25%、26.98%,与模型组比较差异均有统计学意义(P﹤0.05~0.01);而Cdyn则分别增加了168.98%、170.83%%、171.30%,与模型组比差异较具有显著统计学意义(P﹤0.01)。结果表明太子参环肽提取物高中低剂量均能明显降低LQIS-COPD大鼠的肺气道阻力,而显著增加其肺动态顺应性,太子参环肽提取物对肺气虚证慢性阻塞性肺疾病模型大鼠具有良好的干预作用。

4讨论

COPD是一种常见疾病,吸烟或被动吸烟是引发该疾病十分重要的因素。气道阻力及气流受限是COPD的发展进程中的主要特征,气道阻力的增加会导致肺內残留气体过多,從而引发肺和胸廓的顺应性下降及呼吸功能障碍。本研究采用了RL及Cdyn两个指标,判定太子参环肽提取物对LQIS-COPD的干预作用,其中RL反映了大鼠大气道的气流阻力情况,而Cdyn则反映了大鼠小气道的气流阻力及胸廓和肺组织的弹性状况。研究结果显示,太子参环肽提取物对烟熏+木瓜酶蛋白造模所产生的气道阻力升高及肺部动态顺应性降低具有显著的抑制作用,从而证明了太子参环肽提取物对肺气虚证LQIS-COPD模型大鼠的干预作用。

COPD疾病易长期反复发作,且久病难以治愈,从而损伤肺气。肺主气,司呼吸,控制一身之气生成,肺气虚损则肺失治节,则气机不畅,宗气不足,营卫功能失调,从而外邪入侵,痞满壅肺,引发咳嗽、肺胀、气喘等现象。太子参补益肺气具有润肺止咳之功效,本文从肺气虚证入手,探讨太子参益气养阴的药理作用;以活性为导向,探索环肽类特色物质在太子参中所担当的“活性角色”,对于进一步研究太子参的药效物质基础具有重要意义。

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