精浆ROS、PON-1、MDA联合精子DNA碎片指数在男性不育症患者中的研究

刘利敏,谢庆东,凌晓辉,余 相,陈志云

(1.惠州市中心人民医院生殖医学中心,广东惠州 516001;2.汕头大学医学院生殖医学中心,广东汕头 515041)

男性不育症是指夫妻双方未采取任何避孕措施，规律性生活1年以上，因男方因素导致女方未自然受孕。男性不育症发病因素多样，约70%的患者难找到发病原因[1]。

氧化应激条件下，机体常常会产生高活性分子，如活性氧(ROS)，其可引起机体氧化-抗氧化系统的失衡，导致脂质过氧化物损伤，从而引起男性不育症[2]。对氧磷酶-1(PON-1)为机体内非常重要的抗氧化酶，其活性降低亦可导致不育[3]。丙二醛(MDA)是ROS的脂质过氧化醛式产物，可损伤精子的细胞膜，从而导致不育[2]。精子DNA的完整性和DNA碎片指数(DFI)是判断精子DNA损伤的重要指标，精子DNA的损伤可导致男性不育[4]。

本研究通过分析男性不育症患者的精浆ROS、PON-1、MDA和精子DFI水平，以期为男性不育症的诊断及治疗提供一些临床依据。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年6月至2018年6月在惠州市中心人民医院就诊的50例男性不育症患者纳入试验组，年龄22～40岁，平均(26.32±4.13)岁。纳入标准：(1)婚后正常性生活，未避孕1年以上不育，明确诊断为男性不育症；(2)无睾丸外伤、性腺不全、性功能障碍及家族遗传性疾病等；(3)体检无明显睾丸、附睾和输精管异常。排除标准：(1)患有严重的心血管、呼吸系统、内分泌系统疾病等；(2)睾丸和睾丸后因素而导致的不育者；(3)患有外伤或者感染疾病。对照组的精液来自二胎孕前检查者50例，年龄21～39岁，平均(28.42±2.75)岁。

1.2试验方法 (1)精液采集：按照《WH人类精液检查和处理实验室手册》的标准进行精液采集：受试者在标本采集前禁欲2～7 d，手淫法采集精液，置无菌采精杯中，立即送男性实验室进行精液常规、精浆ROS、PON-1、MDA和精子DFI检测。(2)精液常规检查：精液液化后，观察精液颜色，检测精液量，使用西班牙SCA精液分析系统进行精子浓度、精子存活率及前向运动精子率等检查。(3)ROS、PON-1、MDA检测：将患者精液离心，获取精浆，分别置不同的试管中进行检测。ROS检测使用ELISA法，试剂盒购自上海欣乐生物有限公司；PON-1检测使用分光光度法，试剂盒购自上海希美生物科技有限公司；MDA检测使用硫代巴比妥酸法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。(4)精子DFI检测：精子染色质扩散法，试剂盒购自深圳市博锐德生物科技有限公司。按照试剂盒的说明书进行操作，光学显微镜下观察比较至少500个精子的精子核和核周晕轮，计算DFI。

2 结 论

2.1两组精液常规检查结果比较 与对照组比较，试验组患者精子浓度、精子存活率及前向运动精子率均明显降低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，精液量两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者精液常规检查结果比较

2.2两组患者精浆ROS、PON-1、MDA和精子DFI比较 与对照组比较，试验组精浆ROS、MDA和精子DFI显著升高，精浆PON-1水平明显降低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1 男性不育症患者精浆ROS、PON-1、MDA与精子DFI的相关性分析图

组别n精浆ROS(U/L)精浆MDA(nmoL/mL)精浆PON-1(U/mL)精子DFI(%)对照组50463.91±167.585.75±1.184.02±0.6913.05±5.54试验组50736.33±247.5816.00±4.241.25±0.2537.76±6.43P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.3男性不育症患者精浆ROS、PON-1、MDA与精子DFI的相关性分析 男性不育症患者精浆ROS水平与精子DFI之间呈正相关(r=0.538，P<0.05)，精浆MDA水平与精子DFI之间呈正相关(r=0.737，P<0.05)，精浆PON-1与精子DFI之间呈负相关(r=-0.371，P<0.05)。见图1。

3 讨 论

近年来，不孕不育率呈逐年上升的趋势，其中男性因素导致不育的概率约50%。男性不育症对家庭和谐造成严重影响，而引起男性不育症的因素多种多样，其中较为常见的原因为精液异常。因此，有效评估精液的质量对于不育症的诊断及预后非常重要。目前绝大多数男性不育症患者仍然依靠精液常规检查，但是精液常规检查亦存在一定的缺陷，一部分精液常规检查各项参数及精子形态学正常的男性，仍出现不育情况。故寻求新的更准确、更全面的方法或者生物学指标，对于男性不育症的诊断和预后具有极其重要的意义[5-6]。

在精子的形成过程中，氧化应激反应极易对精子造成损害。氧化应激过程中产生的ROS可以使精子细胞膜发生脂质过氧化反应，生成的脂质过氧化物可导致精子的形态学、功能和代谢发生异常。同时，ROS还可以通过影响精子核酸及蛋白质的异常，从而破坏精子DNA的完整性，引起精子DNA碎片指数升高，继而导致不育[7-8]。本研究结果显示，试验组患者精浆ROS水平较对照组明显升高，ROS水平与精子DFI呈正相关(r=0.851，P<0.05)，这表明不育症男性的精子可发生脂质过氧化反应，导致精子DNA碎片增加，这可能与精子细胞膜蛋白质受体和转运蛋白质的结构改变有关。

PON是由肝脏产生的一种酶，常存在于高密度脂蛋白中，有PON-1、PON-2和PON-3 3种亚型。3种亚型中的PON-1为机体内对抗氧化反应的重要磷酸酯酶，通过与高密度脂蛋白中的ApoA1结合，降低脂质过氧化产物的聚集而达到抗氧化作用。已有研究证实，PON-1的活性降低可降低精子数量，改变精子形态和活动力，是男性不育症的重要危险因素[9-10]。本研究发现，与对照组相比，试验组患者精浆PON-1水平明显下降，PON-1水平与精子DFI呈负相关(r=-0.753，P<0.05)，这表明不育症男性的精子抗氧化反应作用减弱，导致精子DNA碎片增加，这可能与精子细胞膜ROS产量增加，PON-1的消耗增多，氧化/抗氧化系统的失衡有关。

MDA是机体细胞膜多聚不饱和脂肪酸的脂质过氧化产物，具有细胞毒性作用，可破坏精子细胞膜的完整性和流动性，导致精子的运动能力下降或者丧失，从而影响受孕能力。研究表明，MDA可影响精液常规参数，也可使精子活力丧失，在男性不育症中发挥着重要作用[11]。本文研究揭示，试验组患者精浆MDA水平较对照组明显升高，MDA水平与精子DFI呈正相关(r=0.623，P<0.05)，与ROS水平的升高趋势一致，这与甄锦壮等[12]和季兴哲等[13]的研究结果一致，提示精浆MDA能够间接反映精浆ROS的活性和精子DNA的损伤程度。

精子DNA是人体遗传信息的携带者，其基因突变、缺失、含量改变等均可导致DNA的完整性受到损伤，从而影响受精和胚胎发育。已有不少研究表明，精子DNA损伤与男性不育症有着密切的关系，可影响精子的存活率和浓度[14]。因此，近年来，对于判断精子DNA损伤标准的DFI在男性不育症中的作用越来越得到重视，逐渐成为生殖医学的研究热点。本文研究结果显示，试验组患者精子DFI较对照组明显升高，这验证了男性不育症患者中DNA损伤的存在。

4 结 论

男性不育症患者精子浓度、精子存活率及前向运动精子率均明显降低，精浆ROS、MDA和精子DFI显著升高，精浆PON-1水平明显降低，精浆ROS、MDA水平与精子DFI之间呈正相关，精浆PON-1与精子DFI之间呈负相关。因此，精浆ROS、PON-1、MDA水平和精子DFI的检测可以为男性不育症的诊断和治疗提供依据，具有一定的临床应用价值。