基于HPLC联合ICP-MS法测定活血止痛胶囊中总砷、可溶性砷、价态砷

陈荣，张华锋

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）

活血止痛胶囊组方为当归、三七、醋乳香、冰片、 土鳖虫、锻自然铜等六味，收录于2015年版《中国药典》一部，功能为活血散瘀，消肿止痛，用于跌打损伤，瘀血肿痛。《中国药典》[1]对此药含铅、砷、汞量作出规定，其中砷含量不得过300 mg/kg，远高于一般药物的2 mg/kg。有研究表明[2]，当归药材对砷元素有明显吸附作用，对不同产地三七样品进行分析，砷超标率为32.4%[3]，土鳖虫由于人为增重，食物团比虫体含砷量明显提高[4]，自然铜作为一种矿物药，成因复杂，往往含有较高的重金属及有害元素。因此，评价活血止痛胶囊安全性必须要考虑砷含量问题。而不同砷价态，毒性差别很大。毒性一般为无机砷＞有机砷，亚砷酸（三价砷）＞砷酸盐（五价砷）＞一甲基砷、二甲基砷，砷甜菜碱和砷胆碱无毒[5]。本实验采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定活血止痛胶囊中总砷及可溶性砷含量，再以高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）法测定价态砷的含量，以期为科学评价活血止痛胶囊安全性提供参考。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器与试剂

仪器：7900电感耦合等离子体质谱仪、Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；CEM MARS 6 CLASSIC 微波消解仪（美国培安公司）；Millipore Synergy超纯水机（美国Millipore公司）；SK5200 HP超声波清洗器（上海科岛超声仪器有限公司，53 kHz，200 W）；Thermo Fisher Multifuge X3离心机（美国Thermo Fisher科技公司）。

试剂：亚砷酸（AsⅢ，1704）、砷酸盐（AsV，1704）、一甲基砷（MMA，1707）、二甲基砷（DMA，1704）、砷甜菜碱（AsB，1607）和砷胆碱（AsC，1607）溶液标准物质均购于中国科学计量研究院；砷单元素标准溶液（174049-3）购于国家有色金属及电子材料分析测试中心，浓度为1 000 μg/mL；内标溶液（含Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb 各 100 μg/mL）和调谐液（含 Ce、Co、Li、Mg、TI、Y 各 1 μg/L）均购于美国Agilent 公司。胃蛋白酶和胰蛋白酶均为生化试剂，购自国药集团化学试剂有限公司，酶活力（U/g）分别为≥1 200和≥50 000。实验用水为Millpore超纯水机所产超纯水，其他试剂均为优级纯。

1.2 材料

本实验共收集7批样品，其中A厂3批（16070119、16080118、17020128，编号1、2、3）；B厂3批（20161208、20161011、20161209，编号 4、5、6）；C 厂 1 批（160915，编号 7）。

2 方法与结果

2.1 总砷量和可溶性砷含量测定

2.1.1 ICP-MS工作条件以高纯氩为工作气和载气，氦气为反应气；采用碰撞反应池模式；射频功率1550 W；载气流量1.09 L/min；采样深度10.0 mm；雾化室温度2℃；数据采集重复次数3，积分时间1 S；蠕动泵转速0.1 rps。

2.1.2 对照品溶液配制精密量取砷单元素标准溶液适量，用2%硝酸稀释至2 μg/mL，作为砷单元素贮备液，再以2%硝酸稀释成0、1、5、10、50 ng/mL的系列标准溶液。

2.1.3 供试品溶液制备

2.1.3.1 总砷量供试品制备取供试品10粒，将内容物研细混匀，取供试品约0.4 g，精密称定，加硝酸8 mL，置加热板上90℃预消解30分钟，冷却后用微波消解仪消解。消解程序：1000 W，爬坡5分钟，120℃保持10分钟；1400 W，爬坡10分钟，185℃保持25分钟。取出，将消解液转入50 mL塑料量瓶中，用水洗涤3次，洗液合并于量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。离心（3 000 r/min，5 min），精密量取上清液1 mL，置50 mL塑料量瓶中，用水稀释至刻度，即得。同法制备空白溶液。

2.1.3.2 可溶性砷供试品制备取供试品10粒，将内容物研细混匀，取供试品约0.3 g各两份，精密称定，置50 mL塑料量瓶中，分别加入人工胃液和人工肠液至刻度，并称定重量。超声使供试品彻底溶散，再置于37℃水浴中超声2 h（53 kHz，200 W）并不时震荡摇匀。冷却过夜（＞24 h），精密量取中层液体10 mL置离心管中，离心（3 000 r/min，5 min），精密量取上清液5 mL，至10 mL塑料量瓶中，加0.02 mol/L EDTA-2Na至刻度，精密量取1 mL至顶空进样瓶中，加2 mL硝酸和0.5 mL盐酸，密闭，90℃烘箱中反应1 h，冷却后用水洗入10 mL塑料量瓶中，并稀释至刻度，即得。同法制备空白溶液。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 线性关系考察按测定条件以对照品质量浓度为横坐标（X），对照品峰强度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

Y= 0.0017X+ 1.6811×10-5（R= 1.0000），线性范围1～50 ng/mL。

2.1.4.2 重复性试验将样品1（16070119）分别按照2.1.3.1、2.1.3.2方法各制备6份，测得总砷量RSD（n=6）为7.8%，测得可溶性砷含量RSD（n=6，人工胃液）11.5%和RSD（n=6，人工肠液）为10.8%，说明该方法重复性良好。

2.1.4.3 加样回收试验称取样品5（20161011）约0.2 g，精密称定，在测定总砷量时精密加入砷单元素标准 溶 液（1 000 μg/mL）40、60、80 μL（ 各 3份 ），按照2.2.3.1项下方法制备，测得平均加样回收率为98.4%，RSD（n=9）为9.4%；在测定可溶性砷含量时精密加入砷单元素贮备液（2 μg/mL）200、250、300 μL（各3份），按照2.2.3.2项下方法制备，测得人工胃液处理的平均加样回收率为89.2%，RSD（n=9）为11.7%，测得人工肠液处理的平均加样回收率为90.8%，RSD（n=9）为7.2%。

2.1.4.4 检出限标样空白溶液连续测定11次，以信号响应值的标准偏差（δ）的3 倍所对应的质量浓度作为检出限，测定砷的检出限为0.01 ng/g。

2.1.5 总砷量和可溶性砷含量测定7批样品的可溶性砷含量低于总砷量，占总砷比例较低。见表1。

表1 砷含有量测定结果

2.2 价态砷含量测定

2.2.1 ICP-MS工作条件和HPLC色谱条件 ICP-MS工作条件、参数设置与2.1.1基本相同，载气流量1.10 L/min，蠕动泵转速0.4 rps。色谱柱：Hamilton PRP-X100（250×4.1 mm，10 μm），0.025 mol/L 磷酸二氢铵溶液（氨水调节pH至8.0）为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱（0～15 min，流动相A从0→100%；15～20 min，流动相A从100%→0；20～25 min，流动相A为0），流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL。

2.2.2 对照品溶液制备精密称取亚砷酸、砷酸盐、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱和砷胆碱适量（以砷As计），加水制成各含2 μg/mL的混合标准贮备溶液，再加 0.02 mol/L EDTA-2Na制成 0，5，20，50，100，500 ng/mL的系列混合标准溶液。

2.2.3 供试品溶液制备同2.1.3.2项下方法制备，并同法制备空白。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察按测定条件以各价态砷质量浓度为横坐标（X），以及相应峰强度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，各价态砷在相应范围内呈良好线性关系，见图1及表2。

图1 6 种价态砷 HPLC-ICP-MS 色谱图

2.2.4.2 重复性试验7批样品都只检出亚砷酸（AsⅢ），将样品1（16070119）分别按照2.2.3方法制备6份，测得亚砷酸根含量RSD（n=6，人工胃液）为7.5%和RSD（n=6，人工肠液）为11.0%，说明该方法重复性良好。

表2 各价态砷线性关系

2.2.4.3 加样回收试验称取样品5（20161011）约0.2 g，精密称定，分别加入亚砷酸根溶液标准物质0.04、0.06、0.08 g（以砷 As计，浓度为 75.7 μg/g），精密称定各 3 份，按照2.2.3项下方法制备，测得人工胃液处理的平均加样回收率为91.9%，RSD（n=9）为6.3%，测得人工肠液处理的平均加样回收率为88.4%，RSD（n=9）为9.2%。

2.2.4.4 检出限以信噪比（S/N）为3∶1时所对应的浓度为检出限，计算得到6种价态砷的检出限分别为：砷胆碱0.19 ng/g；砷甜菜碱0.25 ng/g；亚砷酸根0.35 ng/g；二甲基砷0.50 ng/g；一甲基砷1.02 ng/g；砷酸根0.04 ng/g

2.2.5 样品中砷价态的测定7批样品三价砷含量测定结果见图2及表3。

图2 样品HPLC-ICP-MS 色谱图

表3 样品中三价砷含量测定结果

3 讨论

含重金属中药的毒性与所含重金属元素价态、形态密切相关，仅采用重金属总含量来判定药物的安全性并不合理。特别是中药复方制剂配伍，及中药中重金属在体内吸收、代谢变化规律都有待进一步研究。

活血止痛胶囊是含矿物药自然铜的复方制剂，生产前后存在砷污染的高风险。本实验采用微波消解技术提取总砷，同时模拟人体胃肠道环境，分别以人工胃液、肠液提取可溶性砷、价态砷，结合HPLC-ICPMS技术进行测定，结果显示①活血止痛胶囊可溶性砷及价态砷均远低于总砷含量，按照体重60 Kg每日最大摄入量3 g计算，可溶性砷摄入量也远低于WHO规定的0.12 mg[6]。②3家厂商测得总砷量相差较大，但同一家不同批次间相差不多；③7批样品经人工胃液和肠液分别提取后测得的可溶性砷含量，人工胃液＞人工肠液，各批亚砷酸占可溶性砷的比例，人工肠液＞人工胃液。多数含有砷的矿物药是以As（Ⅲ)、As（V）的形式存在，其中As（Ⅲ）毒性更高（约是五价砷的60倍），是造成急性砷中毒的主要凶手[7]。而重金属及有害元素的生物活性只有在被吸收后才能表现出来，因此在活血止痛胶囊中控制可溶性砷及三价砷含量比单纯控制总砷量更为重要。

活血止痛胶囊虽然存在总砷量较高的风险，但在人体内溶出量有限，价态砷含量很低，这可能是因为：①方中采用锻自然铜入药，自然铜是硫化物类矿物黄铁矿（FeS2)，晶型多呈立方体，集合体呈致密块状[7]，经锻淬后，有害元素大大下降，随着炮制温度升高，砷、铅含量均下降[8]，主成分FeS2化学性质稳定，难溶于水，微溶于酸，消解困难，在人胃肠液作用下，砷很难溶出；②本实验只检出亚砷酸，且含量与可溶性砷量并不成正比，可能方中砷以实验以外其他价态存在；③方中其他药材如果在源头控制住质量，砷超标的风险就会降低，价态砷也不会超标。

综上所述，控制含砷风险高的中成药质量，测定可溶性砷及砷价态含量比单纯制定总砷标准更为科学合理。本实验采用ICP-MS法测定活血止痛胶囊总砷量及可溶性砷含量，同时采用HPLC-ICP-MS测定本品价态砷含量，为活血止痛胶囊的安全性评价提供参考。