鸡安卡拉病卵黄抗体的制备与应用研究

李心海 迟 兰 张林吉 （徐州生物工程职业技术学院 江苏 徐州 221151)

2015年6月以来，河南、山东、河北、辽宁、吉林、安徽、湖北等省大多数地区暴发了鸡安卡拉病，该病以鸡心包积液和肝炎为主要特征[1]。该病最早于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区一个肉鸡场发生暴发性流行，因此通常称作鸡安卡拉病。目前该病在世界多个国家均有报道。“心包积液综合征”即安卡拉病毒病就是由Ⅰ群禽腺病毒中特定血清型感染引起的[2]。30日龄鸡易感，随着日龄的增长，鸡的免疫力逐渐增强，死亡率降低，病程1～2周，死亡率最高可达70%，可给养殖户造成巨大经济损失。

鸡安卡拉病是由病毒引起，目前，我国并没有农业部批准使用的疫苗，抗生素对该病疗效不大，没有特效药物可进行有效防控。当疾病发生时，会给养殖户造成严重损失。因此，很有必要开发出高效特异性的药物进行防控。卵黄抗体已经广泛应用于多种疾病防治，且收到良好的应用效果。化学性质很稳定，易于运输和保存；易于商品化生产，价格低廉，效价比高。笔者利用在徐州地区分离到的1株血清4型Ⅰ群禽腺病毒制备油乳剂灭活疫苗，并制备高免卵黄抗体，经过实验室试验证明，高免卵黄抗体可以有效防控鸡安卡拉病的发生和流行。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 在徐州地区某发生疫情的养鸡场采集鸡心、肝等器官，于实验室分离鉴定一株血清4型I群禽腺病毒并保存。

1.1.2 试验动物 30日龄健康肉仔鸡和180日龄健康开产蛋鸡均购自无血清4型I群禽腺病毒感染史的鸡群。

1.1.3 主要试剂 白油、乳化剂Span-80、乳化剂Tween-80等试剂均购自化学试剂商店。

1.2 方法

1.2.1 病毒的增殖 7～10日龄的SPF鸡胚经卵黄囊途径接种0.2ml，置于37℃孵化，每天观察。将24h内死亡的鸡胚直接淘汰，收获24h后死亡的鸡胚尿囊液，每胚可收取5～10ml的尿囊液。-20℃保存备用。

1.2.2 灭活疫苗的制备 （1）灭活：-20℃保存的尿囊液加入甲醛溶液，混合搅匀，使甲醛溶液的浓度为0.1%。置37℃灭活16h，每隔3～4h振摇1次，即得灭活抗原。（2）疫苗制备：白油与Span-80按比例混匀成油相。灭活抗原与Tween-80按比例混匀成水相。将3份油相与2份水相混匀并乳化成油包水型血清4型I群禽腺病毒灭活疫苗。

1.2.3 免疫方法 选用180日龄健康产蛋鸡30只，体重2kg左右，按正常饲养要求进行饲养。对鸡皮下及肌肉多个部位注射。第一次免疫剂量为0.2ml/kg，在基础免疫后的第14d、21d再进行加强免疫，免疫剂量分别为0.4ml/kg、0.8ml/kg。三免后每隔60d再进行免疫，免疫剂量为0.8ml/kg，在腿部肌肉注射。同时选用10只产蛋鸡，并于同部位注射相同剂量的灭菌生理盐水作为对照组。将所产鸡蛋收集并作好记录，于4℃保存备用。

1.2.4 高免卵黄抗体监测 于首次免疫后7、14、21、30、60、120、180d分别收集免疫组和对照组的鸡蛋，无菌收集蛋黄，制成高免卵黄抗体。以制备的灭活抗原为检测抗原，采用琼脂扩散试验方法测定免疫组和对照组的卵黄抗体效价。

1.2.5 高免卵黄抗体的制备 （1）收集经琼脂扩散试验方法测定卵黄抗体效价在6log2以上的鸡蛋。先用水清洗蛋壳上的污渍，再用0.1%新洁尔灭溶液浸泡30min。（2）分离蛋黄：将蛋壳表面用酒精棉球擦拭清洁，打开蛋壳，倒出蛋清，取出蛋黄，收集蛋黄放入无菌容器。（3）卵黄匀浆：取990份蛋黄液与10份1 %柳硫汞溶液、加入硫酸丁

胺卡那霉素溶液及无菌生理盐水，用组织捣碎机以12000r/min匀浆10min，制备成高免卵黄抗体。1.2.6 成品检验 按照2016版《中华人民共和国兽药典》中的方法进行微生物学检测、稳定性检测、鸡胚接种、安全检验。

1.2.7 治疗试验 将100只30日龄健康鸡平均分成5组，各组均肌肉注射2.1中制备的病毒液0.5ml，24h后，第一组颈部皮下注射卵黄抗体0ml，第二组颈部皮下注射氟苯尼考溶液1ml，第三组颈部皮下注射环丙沙星溶液1ml，第四组颈部皮下注射利巴韦林1ml，第五组颈部皮下注射卵黄抗体1ml。隔离观察，按常规要求饲养，观察2周，对每组鸡的死亡数与治愈数进行统计，分析使用不同药物对人工感染血清4型I群禽腺病毒仔鸡的治疗效果。

1.2.8 预防试验 将80只未免疫的健康仔鸡分成4组，每组20只。第1组注射卵黄抗体1ml，2d后再攻毒；第2组注射卵黄抗体1ml与攻毒同时进行；第3组先攻毒，2d后再注射卵黄抗体1ml；第4组不注射卵黄抗体仅作攻毒对照。

1.2.9 抗体消长规律试验 选未免疫30日龄健康鸡40只，平均分成2组，第一组每只胸部肌肉注射卵黄抗体0ml，第二组每只胸部肌肉注射卵黄抗体1ml，每2d采血一次检测血清4型I群禽腺病毒的抗体效价。

2 结果

2.1 高免卵黄抗体监测结果 如表1所示，在疫苗免疫后，2周后免疫母鸡所产蛋卵黄中血清4型I群禽腺病毒抗体效价超过了4log2，30d后抗体效价超过了6log2，符合采收要求。

2.2 常规检验结果 （1）微生物学检测：将卵黄抗体接种于厌氧肉汤培养基和普通琼脂斜面，37℃培养48h，没有发现细菌生长。（2）稳定性检测：取油乳剂灭活苗10ml，经3000r/min离心20min后，油乳剂外观没有出现分层、破乳等变化。（3）鸡胚接种：用生理盐水将卵黄抗体10倍稀释，经卵黄囊途经接种7日龄SPF鸡胚10枚，每枚0.2ml，置于37℃恒温箱孵育7d，24h内没有鸡胚死亡。（4）安全检验：取30日龄健康鸡10只，均胸部肌肉注射卵黄抗体2ml，饲养14d，所有试验鸡均健康。

表1 免疫鸡卵黄抗体效价测定结果 (log2)

图1 免疫鸡卵黄抗体效价测定

2.3 治疗试验效果 如表2所示，对照组的20只肉仔鸡全部死亡，注射抗菌及抗病毒药物1.0ml的20只肉仔鸡分别死亡19、20、19，注射卵黄抗体肉仔鸡无死亡，治愈率分别为0、0、0、0和100%。

表2 不同剂量卵黄抗体治疗效果 (ml、只)

2.4 预防试验 如表3所示，第一组注射卵黄抗体1ml，2d后再攻毒，20只鸡观察10d，精神状态良好，预防保护率100%。第二组注射卵黄抗体1ml与攻毒同时进行，20只鸡在观察期间，健康良好，预防保护率100%。第三组先攻毒，2d后再注射卵黄抗体1ml，20只鸡在观察期间，有6只死亡，出现精神沉郁，拉黄绿粪便，呼吸困难等症状，其余鸡只健康。治疗保护率70%。第4组不注射卵黄抗体仅作攻毒对照，20只鸡在观察期间，全部发病死亡，出现精神沉郁，拉黄绿粪便，呼吸困难等症状，剖检可见心包积液，肝脏肿大。发病率100%，死亡率100%。

2.5 抗体消长试验结果 如表4所示，鸡只注射1ml卵黄抗体后，即可获得较强的免疫保护。随着日龄的增加，鸡只体内抗体效价逐渐降低。至第10d时，抗体效价为2.7log2，仍可对鸡只产生有效的免疫保护。

表3 卵黄抗体预防试验结果

表4 抗体消长试验结果(平均值)

图2 抗体消长试验结果

3 结论

本试验结果证明：抗生素和抗病毒药治疗禽腺病毒病几乎无效，高免卵黄抗体治疗禽腺病毒病，治愈率达100%，预防保护率达100%，可有效保护鸡只10d左右。高免卵黄抗体对禽腺病毒病有良好的预防效果，在生产过程中并不能确定鸡群感染血清4型Ⅰ群禽腺病毒的具体时间，因此，应及早预防。在禽腺病毒病流行时可以连续两次注射高免卵黄抗体进行紧急治疗，也可用于预防，可以有效减少养殖户的经济损失，是目前比较理想的防控血清4型I群禽腺病毒的生物制品。