生物絮团养虾场幼苗阶段零换水添加益生菌的效果分析

2019-06-26黄经献

中国水产 2019年6期

译/黄经献

凡纳滨对虾是沿海非常重要的养殖物种，近年来由于病害、水质等问题导致养虾场损失惨重。为了减少损失，养虾场开始在生物絮团系统中养虾。这种系统通过限制水交换为养殖品种营造良好的水环境。通过严格管理不换水，在养殖系统中积累有机物和营养物促进微生物菌落生长，多样化微生物稳定了系统，比如转化微生物产生的氮化合物，维持水质、提供营养，通过降低饲料消耗比，降低了饲料成本，提高了养殖生物健康状况。近年来，高密度养虾场开始应用微生物群落，然而相关研究非常少。益生菌包括一些潜在的有益菌作为饵料添加剂被使用。水产养殖过程中，微生物群和养殖物长期接触，物种与环境之间有着直接的相互作用。Verschuere发现水产养殖添加益生菌的新功能，比如影响养殖水中微生物菌落和水质量。有报道称益生菌能促进酶消化，提高机体免疫力，促进生长，实验室可控环境结果显示非常有效。但养殖场中环境每天变化，动态环境、自然界微生物等影响益生菌效果。在养虾场很难频繁地进行可控的生物鉴定，结果不可靠。因此一些养虾场应用的益生菌与自然菌群的效果差异缺乏有效评估。我们探索方法来评估有益菌在提升有益细菌数量、水质和虾生产参数等方面的功效，评估两种商品化益生菌对养殖场异养、弧菌、硝化作用的影响以及对零换水养殖凡纳滨对虾期间沉淀物、含氮化合物和生产参数的影响，本研究结果将对生物絮团养虾场提供有益的信息。

一、材料及方法

（一）实验设计

本实验在墨西哥锡纳罗亚高密度养虾场进行，该公司在生物絮团系统中养殖凡纳滨对虾，90天可达10g/尾～12g/尾，包括30天零换水、60天少量（每天3%～5%换水量）换水2个阶段，整个养殖过程添加益生菌。为避免换水过程外界菌落影响，本实验选择零换水养殖阶段在70m3池塘中进行，建立3个处理：添加益生菌的PB1、PB2和未添加的PBN，每个处理3个平行。PB1添加菌类（杆菌、乳酸、乳杆菌、酵母菌）和当地微生物群，各占50%；PB2中添加由一种微量元素混合物（稳定剂和促进生长的酶，各占50%）孵化的益生菌；对照组PBN应用当地自然的微生物群，包括传统的生物絮团系统，未添加益生菌。

（二）益生菌的应用

利用2个有效容积1000L的生物反应器培育菌落，通过底部增氧保证充分通气。盐度为33～35的海水首先用5μm纱网过滤，然后用次氯酸钠消毒，12小时后硫代硫酸钠中和。生物反应器按照1kg/m3用量注入糖浆（有效含量100g/m3）作为碳源，同时加入一种微量元素混合物。益生菌在（30±3）℃水温下培育36小时。在这种条件下异养菌密度能达到80×106CFU/mL～120×106CFU/mL。PB1、PB2池塘在养虾前6天注满，PBN则提前1天注满水。自加满水起，PB1、PB2每3天注入70L益生菌，PBN不接种益生菌。

（三）养殖环境

实验选取同一个公司培育的12天凡纳滨对虾仔虾，规格为7.3mg/尾，以500尾/m2的密度投入长方形池塘中养殖，池塘体积约70m3（20m×3m×1.17m），塘底用高密度聚乙烯覆盖。9个实验池塘置于塑料大棚中（图1），自然光照，采用100Hp/Ha鼓风机充气，气头放入池底，保证氧气充足和固体颗粒悬浮。投苗前6天添加过滤（5μm滤孔）海水，用含35%粗蛋白的饲料喂养，投喂量为虾体重8%～20%，每2小时投1次料。每个池塘每天投入数量不等的糖浆，使每个池塘C:N比保持为12:1。

图1 生物絮团养虾车间

（四）水质监控

每6小时测1次水温、溶氧，每天测2次pH，每周测1次盐度。每3天用沉降测定管测沉淀物，沉降标准为20分钟。总氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐每周测1次。每个池塘取250mL海水，沉淀后取上层水进行以上指标测定。总氨氮采用水杨酸盐（8155）法测定，亚硝酸盐通过重氮化作用测定（8507），硝酸盐采用镉氧化还原法测定（8171）。

（五）生物絮团细菌测定

每3天从每个池塘3个位置均匀取水样，然后在养殖场实验室分析测定。PB1、PB2养虾前6天投入益生菌开始监测。PBN从开始放入虾苗起进行监测，采用平板涂布法测定。每个实验池取3份水样接种。第1至第30天监测活异养菌，样品（30±2）℃温度下在海水琼脂中培养（24±2）小时；同时监测硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆汁糖培养基中培养的弧菌。第15天至30天，监测在海水氧化剂中培育的氧化细菌，培养期在（30±2）℃温度下持续7天～10天。

（六）虾生产参数

在生物鉴定结束时每个池塘取样测算对虾生长速度、成活率和饵料系数。特定生长速率参照Biswas法测定。

特定生长速率=[结束时生长体重（g）-起始体重（g）]/生长周期（天）

（七）数据分析

假设当量（卡方检验）和平均方差被判定，水质参数、细菌密度、存活率、最终体重、特定生长速率、FCR利用单因素方差分析。另外，如果统计分析存在显著差异，则采用多重比较的图基检验分析，数据采用Statistica8.5.1软件处理。

二、结果

（一）水质变化

实验池水质变化相似，所有实验池无显著差异。溶氧变化范围5.22mg/L～5.59mg/L，水温32.4℃～32.7℃，盐度35.3～36.8，固体颗粒2.53mg/L～3.12mg/L，pH6.8～8.3（表1）。总氨氮最高含量出现在第15天，PBN、PB2池塘分别达到2.48mg/L和2.51mg/L，养殖末期降至1.49mg/L～1.61mg/L，实验组间无显著差异（表1）。所有实验组亚硝酸盐随着养殖时间而增加，平均为4.45mg/L～5.63mg/L，不同实验组间无显著差异（表1）。实验开始时，所有实验组硝态氮均为1.0mg/L，随后上升，整个实验期间，平均达17.77mg/L～18.77mg/L，不同实验组间无显著差异（表1）。

（二）细菌种类

为测定数量趋势，细菌浓度转化为Log。所有实验组活异养菌随着养殖时间而增加（图2a）。第1天在PBN浓度比PB1、PB2低。但从第6天开始直到实验结束浓度相似（图2a）。弧菌群落被分为黄色和绿色，黄色随着养殖时间而增加（图2b），但绿色变化的趋势不明显（图2c）。

把实验期分成3个阶段：第1天（开始期）、第15天（中间期）、第30天（结束期），采用单因素方差分析实验组间差异。活异养菌（VHB）第1天在PBN浓度为0.1×106CFU/mL，PB1浓度为0.7×106CFU/mL，PB2浓度为0.4×106CFU/mL，存在显著差异。随后的不同实验阶段活异养菌浓度差异不显著，其中第15天时浓度为3.3×106CFU/mL～4.2×106CFU/mL，第30天时浓度为38.2×106CFU/mL～65.3×106CFU/mL（表2）。氨氧化细菌（AOB）两个实验阶段浓度差异不显著，第15天浓度为1.1×106CFU/mL～1.6×106CFU/mL，第30天浓度为53.7×106CFU/mL～79.8×106CFU/mL（表2）。黄色弧菌（YVLB）不同实验阶段浓度差异显著，第1天浓度为0.9×103CFU/mL～2.4×103CFU/mL，第30天浓度为35.5×103CFU/mL～107.1×103CFU/mL（表2）。绿色弧菌（GVLB）不同实验阶段浓度存在显著差异，第1天为0.023×103CFU/mL～0.22×103CFU/mL，第30天为1.67×103CFU/mL～4.23×103CFU/mL（表2）。

表1 PBN、PB1、PB2养殖过程中水质参数（平均数±标准差）

图2 活异养菌、黄色弧菌、绿色弧菌数量与时间关系

（三）虾生产参数

最初虾苗规格为7.3mg/尾，养殖结束时平均体重为1.44g/尾～1.54g/尾。个体生长速度为1.43g/尾～1.53g/尾，特定生长速率为14.03%/天～14.17%/天，存活率为85.0%～92.37%，饲料转化率为0.83～0.98，不同实验组虾生产参数差异不显著（表3）。

三、讨论

表2 活异养菌、氨氧化菌、黄色弧菌、绿色弧菌各阶段浓度变化

表3 凡纳滨对虾养殖30天后生产参数（平均数±标准差）

实验期间水质参数（pH、溶氧、盐度、水温）符合凡纳滨对虾养殖用水标准，平均值和以往报道相似。当零换水或少换水时，养殖系统中有机物积累促使异养微生物浓度增加，异养微生物利用有机物作为能量来源进行繁殖。本研究结果如预期，异养微生物整个养殖期一直在增加。

实验开始时，与PBN相比，PB1、PB2微生物浓度最高，但自第6天起，实验组PB1、PB2之间不存在显著差异。对照组PBN异养菌的出现是水中自然存在的原因，通过添加糖浆及有机物积累促使浓度增加。实验结束时微生物浓度为38.2×106CFU/mL～65.3×106CFU/mL，Yuniasari和Ekasari评估了凡纳滨对虾孵化期添加益生菌的效果，研究发现整个养殖期细菌数量自第1天的1×104CFU/mL增至第25天的100×106CFU/mL，另外细菌浓度添加组和对照组是相似的。本研究结果显示活异养菌浓度变化趋势与Burford等研究结果是相似的，变化范围为36.4×106cell/mL～50.6×106cell/mL。

整个硝化过程中包括细菌氨氧化和亚硝酸盐氧化。本研究中采用的养殖培养基可以保证氨氧化数量统计的精度，微生物在养殖系统中具有重要的生态地位，它们可以把总氨氮转化为亚硝酸盐。养殖结束时，氨氧化细菌浓度达53.7×106CFU/mL～79.8×106CFU/mL，结果与预期相似，因为硝化细菌依靠含氮化合物增殖，这些氮化合物是由异养菌产生。对一个中等密度养虾场硝化细菌产生研究发现，密度达到10×106cell/mL～100×106cell/mL的细菌种类包括假单胞菌、硝化杆菌、亚硝化螺菌，研究过程采用了分子探针技术，虽然由于某些原因数据没有可比性，但指出了养殖水中存在高密度的悬浮颗粒和含氮化合物。本研究发现存在硝态氮，尽管没有监测到，但应当存在亚硝酸盐氧化细菌。这个结论是基于以前学者研究的整个消化作用进程。

弧菌广泛存在自然海水中，也出现在养虾过程中。这种菌可以引起水生动物各种疾病影响养殖生产。本研究发现在养殖过程中，黄色弧菌浓度逐渐增加，弧菌的高浓度和水体中有机物高负荷有关，这种现象在生物絮团养殖系统中普遍存在。PBN组养殖末期，黄色、绿色弧菌浓度都比较高，分别达107.1×103CFU/mL、4.23×103CFU/mL，但和添加益生菌组相比虾存活率无显著差异。总体来说，弧菌的数量和Luis-Villaseñor报道类似，该学者发现在凡纳滨对虾幼虾生物絮团养殖过程中弧菌密度为1.57×104CFU/mL，高于Brito等报道的0.4×103CFU/mL～2.20×103CFU/mL。需要指出的是，本实验是在养虾场70m3池塘中进行的，不像其它实验在可控的小水体中完成。当细菌群落平衡被打破，弧菌成为条件致病菌。而病原菌与生物絮团系统微生物相互作用或降低疾病发生的概率。本实验养殖30天时，在PB1、PB2和PBN组中，弧菌与异养菌比例分别为0.19%、0.06%、0.22%，与上述抑制效果一致。

本研究发现添加益生菌没有提高虾生产参数，养殖密度为160尾/m2时，特定生长速率与实验室获得的数据（15.7%/天～20.3%/天）相比要低，但存活率（86%～93%）相似。养殖密度为1200尾/m2时，本研究获得的特定生长速率数据比育苗阶段（11.1%/天～11.4%/天）要高，但存活率（97.4%～99.5%）相似，结果显示特定生长速率与养殖密度有关，与存活率无关。一些报道宣称益生菌的使用可以促进水产养殖，也有报道说没有明显效果，甚至滥用益生菌对养殖生物、生态系统有负作用。本实验中PBN组含有益的微生物，零换水促进益生菌增殖。实际上大多数生物絮团实验方案不添加益生菌，但需要做大量工作分析自然微生物的种类及在系统中的作用，Martínez-Porchas和Vargas-Albores称养殖系统中细菌种类及在微观世界功能仍然不确定，因为大多数环境中繁衍的细菌99%以上的种类是不易被培养的，所以微生物种类无法利用传统技术鉴别，这是本实验的局限，但结论对粗略评估商业养殖条件下的细菌群落提供了支撑。