银杏叶标准汤质量评价研究及高效液相色谱指纹图谱的建立*

陈 萍 ，薛佩芸 ，梁馨月 ，杨 锦 ，郭 冬

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046； 2.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003；3.兵器工业卫生研究所，陕西 西安 710065）

银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo bilobaL.的干燥叶，味甘、苦、涩，性平，归心、肺经，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊调脂的功效，临床多用于瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳喘、高脂血症的治疗[1]。主要有效成分为黄酮类和萜类内酯化合物，二者均具有改善心血管系统、调血脂、抗氧化、抗衰老等作用[2-5]。中药饮片的标准汤是通过标准化工艺规程制备而成的单味中药饮片水煎液[6-8]，是标准化中药不同用药形式的参照物，亦为连接传统中药饮片和现代中药制剂的“桥梁”，为实现中药制剂产品的一致性提供了有效途径。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法测定银杏叶标准汤的待测成分含量，建立HPLC指纹图谱对银杏叶标准汤的化学指纹标定，并开展其质量评价。现报道如下。

1 药材、仪器与试药

1.1 药材

试验所用银杏叶饮片（来源见表1）经陕西省中医药研究院杨智峰教授鉴定为正品，经检查，以杂质、水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物及总黄酮苷类成分、萜类内酯成分均合格的15批（编号S1～S15）饮片进行下一步试验。

1.2 仪器

1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；U-2910型紫外-可见分光光度计（日本Hitachi公司）；BT25S型及BS210S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；CP2102型电子分析天平（奥豪斯仪器＜上海＞有限公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；201V1型电热恒温干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）。

1.3 试药

槲皮素对照品（批号为100081-201610，含量为99.1%），山柰素对照品（批号为 110861-201209，含量为93.2%），异鼠李素对照品（批号为301819Y53，含量为99.6%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、磷酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

表1 银杏叶饮片来源

2 方法与结果

2.1 槲皮素、山柰素及异鼠李素含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Welchrom C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（50 ∶50，V／V）；流速：1.0mL／min；检测波长：360 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.1.2 溶液制备

对照品溶液：称取槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含槲皮素 30.14 μg、山柰素 30.36 μg、异鼠李素 19.376 μg的混合对照品溶液。

供试品溶液：按国家卫生部和国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》[9]，取饮片样品150 g，加8倍量水，浸泡30 min，沸腾后加热回流30 min，趁热滤过；药渣加8倍量水，加热回流3 min，趁热滤过，合并滤液，以水定容至2 500 mL，制得供试品原液。精密量取20 mL，水浴蒸至近干，加甲醇-25% 盐酸溶液（4∶1，V／V）20 mL，水浴回流提取 30 min，定量转入 25 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

阴性对照溶液：精密量取水20mL，按供试品溶液制备方法中自“水浴蒸至近干”起同法制备，制得阴性对照溶液。

2.1.3 方法学考察

图1 高效液相色谱图

专属性考察与系统适用性试验：取上述3种溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果，阴性对照溶液在与对照品溶液相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好；槲皮素、山柰素及异鼠李素的保留时间分别为 11.738，20.146，22.529 min，分离度均大于1.5，理论板数均大于6 000。

线性关系考察：分别精密量取混合对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL，置 5 mL 容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液，精密量取10 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性范围见表2。

表2 回归方程与线性范围（n=6）

精密度试验：取混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果槲皮素、山柰素及异鼠李素峰面积的RSD分别为2.70%，2.62%，2.64%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品（批号为160502）溶液适量，分别于室温下放置 0，2，4，8，12，16，20，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果槲皮素、山柰素及异鼠李素峰面积的RSD分别为1.07%，1.36%，1.12%（n=8），表明供试品溶液在室温放置24h内基本稳定。

重复性试验：精密称取供试品原液（批号为160502）适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果槲皮素、山柰素及异鼠李素含量平均值分别为0.033 1%，0.009 4%，0.003 4% ，RSD分别为 1.07%，0.97%，1.50%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的供试品（批号为160502）原液2 mL，共9份，分别加入低、中、高质量浓度的混合对照品溶液，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n=9）

2.1.4 含量测定与出膏率、总黄酮醇苷转移率计算

含量测定：取15批供试品原液各适量，分别依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

表4 指标成分含量及出膏率、转移率计算结果

出膏率计算：精密量取15批供试品原液各100 mL，置质量恒定的蒸发皿中，水浴蒸干，于烘箱105℃干燥至恒定质量，计算出膏率（Y），Y（% ）=m1／100×V／m2×100%（m1为干浸膏质量，V为样品溶液总体积，m2为饮片质量），结果见表4。15批标准汤出膏率为11.63% ～ 16.21%，平均（13.89 ±1.42）%。

总黄酮醇苷转移率计算：分别按如下公式计算总黄酮醇苷转移率，转移率（%）=供试品原液中总黄酮醇苷含量／药材中总黄酮醇苷含量×100%，结果见表4。15批标准汤总黄酮醇苷转移率为41.95% ～69.92%，平均（0.26±0.06）%。

2.2 高效液相色谱指纹图谱建立

2.2.1 方法学考察

精密度试验：取供试品原液（批号为160503）适量，按拟订色谱条件连续进样测定6次，以山柰素为参考峰，计算共有峰相对峰面积和相对保留时间。结果的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液（批号为160503）适量，分别于室温下放置 0，2，4，8，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，以山柰素为参考峰，计算共有峰相对峰面积和相对保留时间。结果的RSD均小于3%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取供试品原液（批号为160503）适量，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，以山柰素为参考峰，计算共有峰相对峰面积和相对保留时间。结果的RSD均小于3%（n=6），表明方法重复性良好。

2.2.2 指纹图谱建立

取15批供试品原液各适量，按拟订色谱条件进样测定，图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）中。参照图谱设为S1，对照图谱生成方法设为平均数，时间窗宽度设为0.10，多点校正，自动匹配，生成对照，分别计算相似度。结果见图2和表5。结果15批银杏叶标准汤与对照指纹图谱相似度均大于0.95，表明一致性良好。

3 讨论

3.1 指标成分筛选

标准汤中槲皮素、山柰素、异鼠李素提取率高、转移率稳定，三者总量（总黄酮苷）能表征提取物的均一性，故采用此三者为质量评价的定量指标成分[9-11]。

3.2 量值传递与质量评价

本研究中主要从标准汤制备、标准汤两方面进行过程评价，所得15批银杏叶标准汤的平均出膏率为（13.89 ±1.42）% ，总 黄 酮 苷 平 均 含 量 为 （55.93±13.79）%；通过建立标准汤的总黄酮苷（槲皮素、山柰素、异鼠李素）含量测定方法，同时建立标准汤特征指纹图谱测定方法，从指纹准确定性和指标成分定量方面实现了对银杏叶标准汤的整体质量评价。

图2 15批银杏叶标准汤特征指纹图谱重叠图

表5 15批银杏叶标准汤相似度评价结果

3.3 参数范围确定

按本研究中所建立的15批银杏叶标准汤各参数均值的75% ～125%计，其参数范围如下：出膏率10.41% ～17.38% ，总黄酮苷转移率 41.95% ～69.91% ，各项实测值均位于标准汤参数范围内，表明银杏叶标准汤质量均一性好。