茶多酚蛋白质相互作用的研究进展

姚其凤,吴正奇,陈小强，周 呤，黄 煌

(湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉 430070)

茶叶,含有丰富的功能活性成分,随着人们对健康的重视,对茶饮品及其相关食品的研究逐渐增加。茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是绿茶等茶类中主要的品质和活性成分,在干茶中含量可达18%～36%,具有治疗和预防肥胖、癌症与心血管疾病等功效[1-3]。茶多酚类分属于儿茶素(黄烷醇类);黄酮、黄酮醇类;花青素、花白素类;酚酸及缩酚类等。以儿茶素为主体的黄烷醇类占多酚类总量的70%～80%,其中儿茶素结构如图1所示。目前已有大量茶多酚与不同种类蛋白质相互作用的研究,表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是主要的儿茶素单体[4],对牛α-乳清蛋白[5]、大豆分离蛋白[6]和β-乳球蛋白[7]等膳食蛋白具有强亲和力。

图1 儿茶素结构示意图

在茶多酚的开发应用过程中,通过共价和非共价键与蛋白质相互作用形成可逆或不可逆的复合物,影响茶食品的品质和口感,因此茶多酚-蛋白质相互作用被食品学术界广泛研究。如Monteleone等[8]认为多酚与唾液蛋白结合导致涩味和苦味;Georgiades等[9]发现茶多酚与胃和十二指肠粘蛋白相互作用导致沉淀和凝胶化,进而影响人体对茶食品在消化过程中的吸收;Wu等[10]指出EGCG使脂肪酶的催化活性丧失等。

本文介绍了茶多酚-蛋白质相互作用对蛋白质功能性的影响、二者相互作用机理及影响因素,主要对二者相互作用研究方法的进展进行了综述,为茶多酚和蛋白质相互作用研究的方法提供了理论依据和方法。

1 茶多酚与蛋白质相互作用对蛋白质的功能特性的影响

蛋白质的功能特性是指食品体系在加工、贮藏、制备和消费期间影响蛋白质在食品体系中性能的物理和化学性质[11]。蛋白质作为食品中主要的基础功能成分,其功能性大多数影响着食品的感官品质,对食品加工或储存过程中的物理特性起重要作用。目前对于茶多酚与蛋白质相互作用对蛋白质的功能性质造成影响的研究主要集中在蛋白质的起泡性、溶解性、凝胶作用、乳化作用等。且随着蛋白质的种类、茶多酚的浓度、反应条件[12]的不同,对蛋白质功能性质的影响也各不相同。

Wu等[13]发现在1.0%(w/v)的鸡蛋蛋白溶液中加入0.25%(w/v)的绿茶茶多酚可以使鸡蛋蛋白的发泡能力和发泡稳定性增加4～5倍。覃思等[14]认为这是由于活性羟基或羧基的存在使得蛋白质有更大的形成氢键的能力,能够形成更多的有一定机械强度的薄膜,从而更大降低液相的表面张力,提高了发泡能力和泡沫的稳定性。据郭兴凤等[15]的单因素实验及响应面试验结果,确定茶多酚在大豆分离蛋白中的添加量及添加条件为:浓度为1%大豆分离蛋白溶液中茶多酚浓度0.088%,混合温度为21.6 ℃,pH为4.85时,蛋白质溶解性提高。Staszewski等[16]发现茶多酚的存在加速了β-乳球蛋白和酪蛋白巨肽的凝胶化,并且主要影响β-乳球蛋白凝胶的粘弹性。曹艳芸[17]认为EGCG和没食子酸均显著提高了乳清蛋白冷凝胶的凝胶强度,是由于茶多酚与蛋白质的疏水相互作用、以及茶多酚引起的蛋白质结构去折叠化和分子交联均有利于蛋白质的聚集。刘泽宇等[18]添加0.05%以上茶多酚能显著提高草鱼鱼肉蛋白质的乳化稳定性,并延缓乳化能力的降低。

然而,Hu等[19]的研究结果表明,添加茶多酚可明显降低小麦面筋的发泡性和溶解度。这主要是由于茶多酚与相对松散的谷蛋白和茶多酚-谷蛋白交叉的结合,形成了相互稳定的连接网络结构,从而减少了蛋白质在水中的溶解。此外,添加多酚已经破坏了谷蛋白的柔韧性,这使得谷蛋白失去其发泡性质。曹艳芸[17]研究了在中性pH(7.0)和室温环境下,EGCG和没食子酸对天然乳清蛋白和热变性乳清蛋白起泡性质的影响有所不同,二者都能显著提高天然乳清蛋白的起泡性质,但是热变性乳清蛋白起泡性质的变化与多酚浓度有关,多酚浓度过高时会降低热变性乳清蛋白的起泡性质。曹云刚[20]等发现当EGCG浓度为50～200 mg/L时,对于肉蛋白的乳化性和凝胶性无显著影响;当其浓度为500和1000 mg/L时,显著降低了肉蛋白的乳化性和凝胶性。

2 茶多酚与蛋白质相互作用机理及影响因素

2.1 茶多酚与蛋白质相互作用机理

茶多酚多与蛋白质通过疏水作用、范德华力、氢键和离子相互作用等非共价相互作用发生可逆性结合[21-22]。其中,疏水作用和氢键是两者结合的最主要的作用力[23-24]。Avi等[25]研究发现EGCG与β-乳球蛋白通过疏水相互作用和氢键进行结合。Frazier等[26]通过研究四种不同茶多酚与明胶相互作用,认为氢键是主要作用力。Yang等[4]研究结果表明,EGCG通过两步机制自发结合牛乳铁蛋白且氢键总是参与二者复合物的形成。

茶多酚还可与蛋白质通过共价键发生不可逆结合[21]。茶多酚通过氧化或亲核加成形成醌或半醌自由基结构与蛋白质形成共价结构,且茶多酚的结构直接影响了共价键的形成。研究表明共价和非共价结合可以共存[20],如绿原酸与蛋白质的结合[22,27]。

2.2 影响因素

目前对影响茶多酚与蛋白质相互作用的主要因素的研究包括多酚/蛋白质比例[28]、多酚的结构和分子量[29]、温度[30]与蛋白质的种类[31]等。Wang等[28]研究发现,随着EGCG/β-淀粉样蛋白比率的增大,二者的主要相互作用逐渐从氢键转变为疏水相互作用,导致结合从焓驱动到熵驱动的转变。Jia等[29]通过研究β-乳球蛋白与牛乳铁蛋白、阿魏酸和EGCG之间的相互作用,探究了酚酸酯与酚酸结合蛋白质的机理,发现酚酸与蛋白质主要通过氢键和范德华相互作用结合;酚酸酯则主要通过疏水相互作用与蛋白质结合。酚酸酯较酚酸与蛋白质的结合能力强。Kanakis等[30]研究结果表明ECG和EGCG相较于C和EC对蛋白质构象的改变更明显,说明了较大分子量的多酚对蛋白质二级结构的影响较大。Chanphai等[31]的研究发现不同种类蛋白质对茶多酚的亲和能力不同,蛋白质对茶多酚的亲和能力的顺序为β-酪蛋白>α-酪蛋白>β-乳球蛋白。Zhao等[32]通过研究温度对ECG与牛血清蛋白体系的影响发现温度的升高可以显著改善二者的稳定性,从而导致结合常数的上升和结合位点的数量的提高。不同因素对茶多酚与蛋白质相互作用的影响都有差异,这些差异是通过二者相互作用的热力学参数、作用力、结合常数等方面体现出来的。

3 茶多酚与蛋白质相互作用研究方法

3.1 紫外-可见吸收光谱(UV-vis)

UV-vis主要通过比较吸收带的位置及强度的变化来判断蛋白质与多酚是否发生相互作用。此方法具有操作简单、重现性好以及分析速度快等优点。其原理是利用蛋白质的吸收光谱显示出两个主要的吸收峰:200 nm处蛋白质的典型构架构象以及280 nm处芳香族氨基酸。茶多酚的芳香环上π型分子轨道之间的电子跃迁使其在紫外-可见光范围内有特征吸收[33-34],茶多酚的芳香环上π型分子轨道之间的电子跃迁使其在紫外-可见光范围内有特征吸收。

Ye等[35]以紫外-可见光谱的变化探究了红茶多酚和绿茶多酚与牛奶蛋白的相互作用。发现随着牛奶添加量的增加,红茶多酚-牛奶体系和绿茶多酚-牛奶体系的紫外吸收强度逐渐增加。推测是茶多酚的酚羟基与乳蛋白的酰胺基团之间形成了氢键,增加了在多酚的芳香环上的π电子云的强度,导致增色效应[36]。除此之外,还可以通过紫外光谱计算多酚-蛋白的结合常数[34,37],根据Beer-Lambert定律可推导出方程(1)。Kanakis等[38]和Liu等[6]通过此方程分别成功计算出了类黄酮-人血清蛋白复合物的结合常数及不同温度下茶多酚与大豆分离蛋白的结合常数(K),进而表明茶多酚改变了空间结构中芳香族氨基酸残基的微环境和大豆分离蛋白的构象。

式(1)

式中：C茶多酚表示茶多酚的分析浓度,A0和A分别是在茶多酚存在和不存在下280 nm处蛋白质的吸光度。ε蛋白质和εB分别是蛋白质和茶多酚的摩尔消光系数。

然而,该技术通过峰位移,吸收光谱及其强度提供蛋白质与茶多酚相互作用的定性信息[39-40],不足以对茶多酚蛋白质复合物进行相对全面的分析。

3.2 荧光发射光谱

荧光发射光谱在多酚和蛋白质相互作用的研究中应用广泛[41-43]。此方法提供茶多酚与蛋白质相互作用导致的蛋白质三级结构变化的详细信息,具有光谱简化、光谱带宽减少和避免多种干扰效应等优点。其基本原理为某些蛋白质构象的转变、底物的结合和发色团分子环境的变化会导致其固有荧光的变化。通过研究荧光的改变可以帮助理解茶多酚与蛋白质的结合位置[44]并可以通过分析荧光猝灭过程进一步推断二者的结合过程。

Liang等[43]发现原花青素B3可以与溶菌酶相互作用,猝灭其固有荧光。通过Stern-Volmer方程分析处理荧光猝灭数据后,发现双分子猝灭常数值(kq)均高于生物分子的扩散限制速率常数(kd)[43-46],说明儿茶素诱导蛋白质荧光猝灭的机理为静态猝灭。线性Stern-Volmer图通常指示蛋白质中的单一类荧光团,当kq较高时,蛋白质和猝灭剂之间形成了复杂的结合。此时线性Stern-Volmer图不再适用,为了分析此种情况下的蛋白质多酚结合过程,Liang等对Stern-Volmer方程进行了改进。通过修正的Stern-Volmer方程进一步分析原花青素B3对溶菌酶的荧光猝灭过程,证实了静态猝灭机理,并通过计算淬灭常数发现B3的结合能力可以改变溶菌酶的三级结构并促进溶菌酶/B3复合物的形成。通过荧光分析还可以得到配体与蛋白质相互作用的结合常数Kb,结合位点的数量n。其中,n和Kb可以通过log(F0-F)/F对log(1/([Qt]-(F0-F)[Pt]/F0))绘图获得[47]。 Bose[46]主要利用荧光技术得到不同儿茶素衍生物与血清白蛋白的Kb值,并对其大小进行了分析,发现Kb值随着没食子酰基部分的增加而增加,而n值总是接近于1,表示多酚和蛋白质1∶1络合。

荧光发射光谱分析存在一些局限,作为一种局部信号,在蛋白质折叠研究中,荧光无法提供详细的结构信息,需要将荧光变化与圆二色谱、FTIR或NMR信号进行共同分析得到结论[48]。而荧光内滤效应(IFE)可能会影响荧光测量,需在不同条件下检查激发和发射波长处的总吸光度以排除IFE干扰[49]。

3.3 圆二色光谱(CD)

物质的左旋和右旋圆偏振光的 吸收差异产生圆二色性,远紫外圆二色光谱常用于估算蛋白的二级结构含量,如α-螺旋、β-折叠、γ-转角和无规卷曲含量等[50-51]。近紫外CD光谱则能反映蛋白质中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)残基及二硫键所处微环境的扰动,因而能用于研究蛋白质三级结构的精细变化,还能用于辅基结构表征。当茶多酚与蛋白结合后,蛋白质的CD谱的波峰会发生移动,移动方向一般由蛋白质及多酚的类别决定。

Roqanian等[52]研究发现茶多酚的添加使鸡蛋白溶菌酶的CD谱的波峰发生蓝移,且在280和285 nm之间的椭圆率会发生一定变化。而Wallace等[53]则发现原花青素B3与溶菌酶结合会导致208 nm处的波峰红移。通过圆二色光谱可以得到蛋白质在222 nm处的摩尔椭圆率值([θ]222),通过公式fH=-([θ]222+2340)/30300可算出α-螺旋含量(fH)。研究表明,相同条件下茶多酚与不同种类蛋白质相互作用会诱导蛋白质的二级结构含量发生不同的变化[54]。徐洁琼[7]研究发现,相同条件下,β-LG加入溶液中,α-螺旋含量降低、β-折叠及无规卷曲含量增加;而当β-酪蛋白加入溶液中,α-螺旋及β-折叠含量明显降低,转角及无规卷曲含量增加。

CD光谱具有样品耗量少且数据处理量小等特征,可用于研究不同溶剂、温度、pH、盐度及辅助因子下的蛋白质构象。CD光谱也常常与其他技术联用来研究多酚与蛋白质的结合过程中的结构变化。

3.4 傅里叶变换红外光谱法(FTIR)

FTIR作为一种无损检测手段,可有效提供有关多酚-蛋白质复合物中蛋白质链构象和疏水性结合的信息,因而可用于对多酚-蛋白质分子相互作用机制的深入探究。其原理是利用蛋白质二级结构如α-螺旋、β-折叠、γ-转角等的酞胺Ⅰ带、Ⅱ带伸缩振动在红外光谱上表现为特征吸收来观测多酚-蛋白质互作过程中蛋白质二级结构的变化[55-56]。FTIR应用于茶多酚与蛋白质相互作用分析,此方法不需要对蛋白质进行特定标记,在检测过程中不会对原始蛋白质造成干扰,能对整个蛋白质的特定位点同时进行检测[57]。

Kanakis等[30]采用红外光谱法研究了茶多酚-β-乳球蛋白复合物的形成过程。当少量茶多酚被加入进蛋白溶液中后,多酚能与蛋白质结构中的C=O,C-N和N-H基团发生亲水相互作用,使蛋白质酰胺I带和酰胺II带强度增加。另外,他们认为随着多酚浓度增加,蛋白质α-螺旋和β-片层结构增加,导致酰胺I带的光谱强度随之增加。类似地,使用具有二阶导数分辨率增强和曲线拟合程序的红外自解卷积也被用于确定存在茶多酚时的蛋白质二级结构[58]。Al-Hanish等[5]研究发现EGCG可使牛α-乳白蛋白的酰胺I带(1600～1700 cm-1)发生变化,通过对组分条带的积分面积进行计算与分析,发现结合前后蛋白的α-螺旋含量从36.8%下降到28.9%,而β-折叠含量从20.0%增加至26.7%,表明在多酚与蛋白反应后,蛋白的α-螺旋转变为β-折叠。

FTIR可适用于分析不同大小和不同种类的蛋白质,相较于其他方法应用范围更广。但是由于FTIR技术得到峰值拟合结果不够准确,因而很少单独用来表征二级结构,常与CD光谱连用对多酚蛋白质复合物的二级结构进行分析。

3.5 核磁共振波谱法(NMR)

最简单、最早应用的NMR方法是化学位移滴定法,它可以很容易地检测配体是否与其靶蛋白结合,其中解离常数的测量响应于配体滴定反应中的蛋白质的化学位移变化[62]。同时蛋白质表面上的结合位点也可以通过化学位移数据得到。Cala等[63]通过比较单宁添加前后肽的1H化学位移变化再结合公式(2)计算得出了蛋白与单宁的解离常数及结合位点数。

式(2)

式中,Aobs:化学位移变化;Δδi:扩散系数变化ΔDobs;Amax:化学位移差Δδmax或 D单独蛋白质和多酚饱和化学位移之间的扩散差ΔDmax;Kd:解离常数(M);[Ti]:固定肽的多酚的总浓度;[P0]:肽(M)的总浓度;n:多酚结合位点数。

3.6 等温滴定量热法(ITC)

量热技术是获取体系中分子间相互作用热力学信息的直接方法,能够揭示分子间相互作用的存在和相互作用的性质。ITC可通过直接测量两种分子间反应过程中产生的热量,获得包括平衡结合常数K、结合的化学计量数n、吉布斯自由能变化ΔG、焓变ΔH、熵变ΔS在内的多种热力学参数[64]。由于结合热是一种自发生的现象,ITC不需要对反应物进行化学修饰或固定化[65-66],同时测量的反应物的分子量不会影响信号的强度。ITC的这些优点使得其被大量应用在茶多酚和蛋白质互作分析中。

研究表明,在茶多酚与蛋白质结合的过程中,当ΔS和ΔH均小于零,表明主要驱动力是氢键和范德华力[67-68];当ΔS大于0,则通常被认为是疏水相互作用的典型特征[69];当ΔG和ΔH均小于零,表明相互作用过程是自发和放热的,但某些直接的静电相互作用也会引起放热效应[70]。Li等[71-72]利用ITC研究了儿茶素与两种蛋白的相互作用,结果表明,儿茶素与牛血清蛋白的结合由焓和熵驱动,并且主要驱动力是静电相互作用和疏水相互作用。儿茶素与人血清蛋白的结合则是由正焓和负熵驱动的,并且主要驱动力是氢键和范德华力。最近Bose等[46]利用ITC观察到EGCG-人血清蛋白复合物的形成伴随着负焓变、正熵变以及负的ΔG,因此认为EGCG与人血清蛋白的结合是自发性的,并且对于EGCG-人血清蛋白系统,ΔG的大小主要与ΔH有关,蛋白质和配体的部分固定发生在疏水结合的过程中。

另外,ITC也存在着一些缺点,包括耗时,难以实现自动化及高通量筛选,样品需求量大等。

4 总结与展望

茶多酚和蛋白质相互作用被广泛应用于食品加工、机体保健等方面,对于二者间相互作用的研究也日渐增多。然而,由于茶多酚与蛋白质相互作用受多种因素的影响且受限于各种分析方法,所以对于二者相互作用的机理仍不够明确。多种分析方法用于研究茶多酚与蛋白质可逆的非共价相互作用,所有这些方法都提供的证据不够全面,因此有必要将它们结合起来以便于了解。另外,茶多酚与蛋白质共价相互作用受到的关注较少,从二者相互作用的几种可能性来说,共价反应产物似乎是最重要的部分,因为它们不可逆地影响蛋白质和多酚的性质。茶多酚与蛋白质相互作用在机体营养和食品加工等方面受到越来越多的关注,其研究方法的改进是必然趋势,为了建立稳定可靠研究方法,多种检测方法的联用为发展方向。