沙棘多糖清除自由基及抗脂质过氧化作用研究

任 薇,包晓玮,张志芳,韩 蕾,曾兰君,张亚涛

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

沙棘(HippophaerhamnoidesL)又名醋柳、酸刺子[1]。成熟果实呈橙黄色或棕红色,皱缩,果肉油润,质柔软[2]。沙棘化学成分主要有多糖[3]、蛋白质和氨基酸[4-5]及微量元素等[6],在医药方面,沙棘具有延缓衰老、止咳、活血散瘀、缓解心绞痛,防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用[7-8],具有广阔的开发利用前景。

机体的脂质过氧化,会引起诸多疾病(如肿瘤、血管硬化及延缓衰老等)严重危害了身体健康,因而被人们所重视。日常生活中,抗脂质过氧化最简便易行的是食用抗氧化剂,食用抗氧化剂应具备安全无毒、低浓度、高效、稳定性好等特点[9]。廖国会[10]利用体外抗氧化活性法证明松乳菇多糖对DPPH自由基、OH自由基和超氧阴离子自由基都具有一定的清除能力,其IC50值分别为1.55、1.23、8.31 mg/mL,还原能力弱于VC;赵杰[11]试验表明火棘多糖具有体外清除自由基能力和抑制脂质过氧化作用;段小群[12]试验表明青钱柳多糖具有抗脂质过氧化作用;罗敏[13]通过动物体内外试验证明米胚多糖具有一定的抗氧化性。现阶段对沙棘多糖的研究多集中在提取纯化,抗氧化活性方面研究较少。因我国是沙棘属植物种植面积最大,种属最多的国家[14],所以对沙棘多糖抗氧化活性研究对沙棘以后的开发利用存在一定的意义。

本试验采用体外抗氧化活性法测定沙棘多糖对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除能力及总还原能力。通过建立4种肝匀浆体外模型来模拟人体内环境,以VC为阳性对照与沙棘多糖组进行对比。观察过氧化脂质(LPO)主要降解产物MDA含量的变化,反映出脂质过氧化的程度,来评价沙棘多糖对脂质过氧化的抑制作用。以体外模型来模拟体内环境,既能观察到被测物质在生物体内的反映情况,又可以了解该物质在体内详细的反应机理[15],为沙棘资源的综合开发及利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙棘 产地新疆阿勒泰;1.1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国sigma公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris) 美国Amresco公司;抗坏血酸(VC)、硫代巴比妥酸(TBA) 国药集团化学试剂有限公司;昆明种小鼠 20只,雌雄对半,体重(20±2) g,购自新疆医科大学试验动物中心,动物许可证号:SCXK(新)20160003;其他化学试剂 均为分析纯。

TG16B高速离心机 凯特试验仪器有限公司;XH-B涡旋混合器 无锡沃信仪器制造有限公司;超声波药品处理器 济宁金百特电子有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沙棘多糖的提取 沙棘预处理:将沙棘干果置于40 ℃烘箱12 h,每1 h取出称重一次,待重量恒重时粉粹,过40目筛。按照1∶8 (w/v)料液比加入石油醚浸泡1 h后,70 ℃水浴回流1.5 h,抽滤,留滤渣,滤渣以1∶6 (w/v)料液比加入石油醚继续70 ℃加热回流1 h,抽滤,留滤渣,加入80%乙醇至将沙棘完全浸没,70 ℃水浴回流2 h从而脱去单糖,抽滤,滤渣烘干待用[16]。

准确称取预处理后的沙棘5 g,放入锥形瓶,按料液比1∶20 (w/v)加入蒸馏水,超声波药品处理器70 ℃,中频(30 kHz)超声辅助提取22 min,抽滤后加入25%体积的Sevage试剂(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)。在涡旋混合器以2000 r/min混合20 min。混合后,室温下离心20 min,转速为4000 r/min,取上层液重复脱蛋白5次[17],直至离心后无白色胶状层出现。上层液利用旋转蒸发仪70 ℃下浓缩至15 mL,加入3倍上清液体积的无水乙醇,在4 ℃下静置12 h。抽滤,取沉淀经无水乙醇、丙酮、乙醚依次顺序洗涤[18],洗涤后,抽滤,留沉淀40 ℃烘箱干燥至晶体状,即得沙棘粗多糖。

1.2.2 肝匀浆的制备 小鼠禁食12 h后处死,取肝脏,置4 ℃生理盐水中反复漂洗,去除血液,剔除脂肪,用滤纸吸干表面水分。称重后剪碎,冰浴条件下用匀浆器充分研磨,加入生理盐水配成5%的肝匀浆,冷冻离心机4 ℃、3000 r/min离心10 min,取上清液,4 ℃冷藏备用[12]。

1.2.3 沙棘多糖体外抗氧化活性测定

1.2.3.1 沙棘多糖对羟自由基清除率的测定 参考廖国会[10]方法稍做修改。分别取1 mL浓度为0.1、0.5、1、1.5、2.0 mg/mL的沙棘多糖溶液于试管中,各管分别加入800 μL的硫酸亚铁(6 mmol/L)和800 μL水杨酸(6 mmol/L),摇匀后各管加入0.1% H2O250 μL混匀,37 ℃水浴30 min,以蒸馏水为空白对照,以VC为阳性对照,510 nm下测定各反应溶液的吸光度值并按公式(1)计算清除率。试验重复三次。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

式(1)

式中,A0:1 mL H2O+800 μL FeSO4+50 μL H2O2;A1:1 mL沙棘多糖溶液+800 μL FeSO4+50 μL H2O2;A2:1 mL沙棘多糖溶液+800 μL FeSO4+50 μL H2O。

1.2.3.2 沙棘多糖对超氧阴离子自由基清除率的测定 参照Wup[19]的方法。吸取4.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲(pH=8.2)放入试管中,25 ℃水浴20 min,分别加入1 mL 1、2、4、6、8 mg/mL的沙棘多糖溶液和80 mmol/L邻苯三酚20 μL充分混匀。混匀后25 ℃水浴反应5 min,反应后加入200 μL 10 mol/L盐酸溶液来终止反应,VC为阳性对照。325 nm处测定吸光度,按公式(2)计算其清除率。试验重复三次。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式(2)

式中,A1:4 mL Tris-HCl+20 μL邻苯三酚+1 mL沙棘多糖溶液;A2:4 mLTris-HCl+20 μL蒸馏水+1 mL沙棘多糖溶液;A3:4 mL Tris-HCl+20 μL邻苯三酚+1 mL蒸馏水。

1.2.3.3 沙棘多糖对DPPH自由基清除率的测定 参照李珊珊[20]方法稍作改进。在10 mL比色管中分别加入1 mL 1、2、3、4、5 mg/mL的沙棘多糖溶液,再分别加入 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL,无水乙醇定容至刻度。摇匀,室温避光反应30 min,以无水乙醇为空白对照,VC为阳性对照,517 nm处测定吸光度,按公式(3)计算其清除率。试验重复三次。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A×100

式(3)

式中,A1:待测样+DPPH乙醇溶液;A2:待测样+无水乙醇;A0:无水乙醇+DPPH乙醇溶液。

1.2.3.4 沙棘多糖还原能力的测定 参照Lee[21]方法,分别向试管中加入1 mL 0.1、0.5、1、1.5、2.0 mg/mL的沙棘多糖溶液,2.0 mL的PBS(0.2 mol/L,pH6.6)和2.0 mL 1%铁氰化钾,混匀后,50 ℃水浴反应20 min,反应后加入10%三氟乙酸2 mL,3000 r/min,离心10 min。取离心后上层液100 μL,加4400 μL蒸馏水与1%六水氯化铁400 μL,摇匀,反应10 min。700 nm处测定吸光度值。以蒸馏水为空白对照,VC为阳性对照。试验重复三次。

1.2.4 沙棘多糖对小鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用

1.2.4.1 沙棘多糖对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响 试验分为空白对照组、阳性组、沙棘多糖组。各试管先加1.5 mL 5%的肝匀浆,空白对照组加蒸馏水0.1 mL,阳性组加0.1 mL 2 mg/mL的VC,沙棘多糖组分别加入0.1 mL浓度为0.1、0.5、1、2、4、8 mg/mL的多糖溶液,37 ℃水浴振荡90 min,冷却,再向各管中分别加入1 mL 20% 三氯醋酸。混匀,沸水浴振荡15 min,冷却混合液体后离心10 min,转速3000 r/min。取上清加0.67%三氯醋酸1 mL,混匀后沸水浴振荡10 min,冷却后于532 nm处测吸光度值。并计算其抑制率。试验重复5次,抑制率按公式(4)计算[22]。

抑制率(%)=(A对照-A试验)/A对照×100

式(4)

1.2.4.2 沙棘多糖对CCl4体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响 参照郭英[23]方法,试验分为空白对照组、阳性组、沙棘多糖组。首先于各试管中加入5%的肝匀浆1.5 mL,其中空白组加入蒸馏水0.1 mL,阳性组中加2 mg/mL的VC0.1 mL,沙棘多糖组分别加入0.1 mL 0.1、0.5、1、2、4、8 mg/mL的多糖溶液,37 ℃水浴振荡反应15 min,再向各管中加入CCl420 μL,37 ℃水浴30 min后,分别在各管加入1 mL 20% 三氯醋酸,混匀后沸水浴振荡15 min,冷却混合液体3000 r/min离心10 min,取上清加0.67%三氯醋酸1 mL,混匀后沸水浴振荡10 min,冷却后于532 nm处测吸光度值。并计算其抑制率。试验重复5次,抑制率按公式(4)计算。

1.2.4.3 沙棘多糖对H2O2体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响 参照武文洁[24]方法,试验分为空白对照组、阳性组、沙棘多糖组。首先于各试管中加入5%的肝匀浆1.5 mL,其中空白组加入蒸馏水0.1 mL,阳性组中加2 mg/mL的VC0.1 mL,沙棘多糖组分别加入0.1 mL 0.1、0.5、1、2、4、8 mg/mL的多糖溶液,37 ℃水浴振荡反应30 min,再向各管中加入0.1 mL 30% H2O2,继续37 ℃振荡温育30 min后,分别在各管加入1 mL 20% 三氯醋酸,混匀后沸水浴振荡15 min,冷却混合液体3000 r/min离心10 min,取上清加0.67%三氯醋酸1 mL,混匀后沸水浴振荡10 min,冷却后于532 nm处测吸光度值。并计算其抑制率。试验重复5次,抑制率按公式(4)计算。

1.2.4.4 沙棘多糖对Fe2+-VC体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响 参照刘刚[25],试验分为空白对照组、阳性组、沙棘多糖组。首先于各试管中加入5%的肝匀浆1.5 mL,其中空白组加入蒸馏水0.1 mL,阳性组中加2 mg/mL的VC0.1 mL,沙棘多糖组分别加入0.1 mL 0.1、0.5、1、2、4、8 mg/mL的多糖溶液,向各管同时加入2 mg/mL VC和FeSO4·7H2O 各0.14 mL,37 ℃水浴振荡反应60 min后,分别在各管加入1 mL 20% 三氯醋酸,混匀后沸水浴振荡15 min,冷却混合液体3000 r/min离心10 min,取上清加0.67%三氯醋酸1 mL,混匀后沸水浴振荡10 min,冷却后于532 nm处测吸光度值。并计算其抑制率。试验重复5次,抑制率按公式(4)计算。

1.3 数据处理

本试验所有数据以平均值±标准差表示,采用SPSS 19.0软件进行分析,按照统计学分析采用t检验法剖析各组之间的差异,p<0.05为显著性标准,采用SigmaPlot 12.5和Excel进行作图分析,从而得出结果。

2 结果与分析

2.1 沙棘多糖体外抗氧化活性测定结果

2.1.1 沙棘多糖对羟自由基的清除作用 由图1可得,沙棘多糖浓度逐渐增大时,对羟自由基清除率随之增强,其在浓度0.1～2 mg/mL内对羟自由基的清除能力均低于VC,经计算沙棘多糖IC50值为0.97 mg/mL。有研究表明松乳菇多糖[10]与西番莲果皮多糖[26]对羟自由基清除率IC50值分别为1.147和61.06 mg/mL,而沙棘多糖对羟自由基清除能力相比松乳菇多糖较弱,强于西番莲果皮多糖;桑叶茯砖茶多糖浓度在1.75 mg/mL时,对羟自由基的清除率为74.08%[27];菊苣多糖浓度在2.4 mg/mL时,对羟自由基的清除率为40.93%[28],本试验沙棘多糖在浓度2 mg/mL时，沙棘多糖对羟自由基清除率为67.34%,沙棘多糖对羟自由基清除能力相比桑叶茯砖茶多糖较弱,强于菊苣多糖。

图1 沙棘多糖对羟自由基的清除率

图2 沙棘多糖对超氧阴离子自由基的清除率

2.1.3 沙棘多糖对DPPH自由基清除率的测定 由图3可知,沙棘多糖浓度逐渐增大时,对DPPH自由基清除率随之增强,其浓度在1～3与4～5 mg/mL时对DPPH自由基的清除能力增长较快,在3～4 mg/mL对DPPH自由基的清除能力增长缓慢。沙棘多糖浓度在1～5 mg/mL时对DPPH自由基的清除效果较低于VC,而浓度在5 mg/mL时,沙棘多糖与VC对DPPH自由基清除率分别为93.69%和95.28%,清除率相近,廖国会[10]研究得出松乳菇多糖对DPPH自由基的清除IC50值为0.855 mg/mL;李霞[26]研究得出西番莲果皮多糖对DPPH自由基的清除IC50值为0.374 mg/mL。付爱叶[28]研究得出菊苣多糖浓度在2.4 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率为58.17%;敢小双[30]研究得出竹荪多糖浓度在25 mg/mL时对 DPPH自由基的清除率为70.55%。本试验中沙棘多糖的IC50值为1.55 mg/mL,其浓度在2 mg/mL时对DPPH自由基的清除率为63.84%,当浓度在3 mg/mL时对DPPH自由基的清除率为82.94%,对DPPH自由基的清除能力强于浓度为25 mg/mL的竹荪多糖。本试验数据反映出沙棘多糖对DPPH自由基的清除效果相比于松乳菇多糖、西番莲果皮多糖稍弱,强于菊苣多糖和竹荪多糖。

图3 沙棘多糖对DPPH自由基清除率

2.1.4 沙棘多糖还原能力的测定 由图4可知,随着沙棘多糖浓度的增大,还原能力逐渐增强,其浓度在0～0.5 mg/mL时还原能力与同浓度VC无明显差异。沙棘多糖与VC的浓度在1～1.5 mg/mL时,沙棘多糖还原能力增长速率大于VC还原能力增长速率。沙棘多糖浓度在1.3～2 mg/mL时还原能力大于同等浓度的VC。付爱叶[28]研究得出菊苣多糖浓度在2.4 mg/mL时,在700 nm处测吸光度值为0.453,何念武[31]研究得出黄瓜多糖浓度在4 mg/mL时,在700 nm处测吸光度值为0.35,本试验沙棘多糖浓度在2 mg/mL时,吸光度值为0.805。通过以上数据可分析出沙棘多糖还原能力高于黄瓜多糖与菊苣多糖。多糖还原力机理主要为样品中的还原酮通过电子给予能力,阻止自由基链形成,从而发挥抗氧化活性作用[23]。

图4 沙棘多糖还原能力

2.2 沙棘多糖对小鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用

2.2.1 沙棘多糖对小鼠肝匀浆自发脂质过氧化的影响 由表1可知,沙棘各多糖组与VC组在532 nm处吸光度值均低于对照组,表明自发性脂质过氧化模型建立成功。脂质过氧化主要终产物为丙二醛(MDA),MDA在532 nm处有最大吸收波长。吸光度值的大小能够直接反映出肝细胞架构受到自由基攻击的程度。抗氧化剂进入机体内后可对抗自由基,抑制MDA的产生,从而达到抑制脂质过氧化的作用。沙棘多糖浓度在0.1～8 mg/mL时,抑制自发性脂质过氧化作用逐渐增强,存在一定的量效关系(Y=0.06x+0.3582,R2=0.9015,x为沙棘多糖浓度,Y为抑制率)。沙棘多糖浓度在2 mg/mL时抑制自发性脂质过氧化作用稍弱于同浓度VC;其浓度在4 mg/mL时与2 mg/mL VC抑制自发性脂质过氧化作用相近;在4～8 mg/mL抑制自发性脂质过氧化作用高于2 mg/mL VC。经计算沙棘多糖抑制自发性脂质过氧化的IC50为1.10 mg/mL。李永飞[32]研究得出云南松松针多糖浓度在0.1 mg/mL和0.6 mg/mL时抑制自发性脂质过氧化作用抑制率分别为14.7%和31.01%。段小群[12]研究得出青钱柳多糖浓度在0.1和0.6 mg/mL时抑制自发性脂质过氧化作用抑制率分别为13.27%和25.55%。本试验沙棘多糖浓度在0.1 mg/mL和0.5 mg/mL时抑制自发性脂质过氧化作用抑制率分别为29.51%和35.10%。结果表明沙棘多糖抑制率高于云南松松针多糖和青钱柳多糖,抗自发性脂质过氧化作用强于云南松松针多糖和青钱柳多糖。

表1 沙棘多糖对小鼠肝匀浆 自发脂质过氧化的抑制作用Table 1 Suppression of spontaneous lipid peroxidation of liver homogenate in mice

2.2.2 沙棘多糖对CCl4体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响 由表2可知,在小鼠肝匀浆中加入CCl4诱导剂后,通过保温诱导发生脂质过氧化,沙棘各多糖组与VC组在532 nm处吸光度值均低于对照组,表明CCl4体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化模型建立成功。沙棘多糖随着浓度的增大,抑制能力增强,在532 nm处的吸光值呈降低趋势,表明MDA含量降低,脂质过氧化程度降低,且存在一定的量效关系(Y=0.0698x+0.3888,R2=0.9744,x为沙棘多糖浓度,Y为抑制率),经计算沙棘多糖抑制CCl4体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化IC50值为1.59 mg/mL。沙棘多糖在2 mg/mL时与同浓度的VC抑制CCl4体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化作用相比无明显差异,其浓度在4～8 mg/mL抑制CCl4体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化作用高于2 mg/mL VC。

表2 沙棘多糖对CCl4体外诱导小鼠肝匀浆 脂质过氧化抑制作用Table 2 Effect of seabuckthorn polysaccharides on the lipid peroxidation of liver homogenate in mice induced by CCl4in

2.2.3 沙棘多糖对H2O2体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化的作用 由表3可知,在小鼠肝匀浆中加入H2O2,通过保温诱导发生脂质过氧化,沙棘各多糖组与VC组在532 nm处吸光度值均低于对照组,表明H2O2体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化模型建立成功。沙棘多糖浓度在2 mg/mL时抑制H2O2体外诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化的能力高于同浓度VC。随着沙棘多糖浓度的增大,抑制能力增强,且存在一定的量效关系(Y=0.0438x+0.0999,R2=0.9808,x为沙棘多糖浓度,Y为抑制率),经计算其IC50值为9.13 mg/mL。

表3 沙棘多糖对H2O2体外诱导小鼠肝匀浆 脂质过氧化抑制作用Table 3 Inhibitory effect of hippophae rhamnoides polysaccharides on lipid peroxidation of liver homogenate in mice induced by H2O2in

2.2.4 沙棘多糖对Fe2+-VC体外诱导小鼠肝脏脂质过氧化的作用 由表4可知,在小鼠肝匀浆中加入Fe2+-VC,通过保温诱导发生脂质过氧化,沙棘各多糖组与VC组在532 nm处吸光度值均低于对照组,表明Fe2+-VC体外诱导小鼠肝脏脂质过氧化模型建立成功。沙棘多糖浓度在0.1～8 mg/mL时,对Fe2+-VC体外诱导小鼠肝脏脂质过氧化抑制作用均低于2 mg/mL的VC。随着沙棘多糖浓度的增大,抑制能力逐渐增强,且存在一定的量效关系(Y=0.0503x+0.3479,R2=0.9294,x为沙棘多糖浓度,Y为抑制率),经计算其IC50值为1.39 mg/mL。段小群[12]研究得出青钱柳多糖浓度在0.1和4 mg/mL时抑制自发性脂质过氧化作用抑制率分别为23.63%和34.84%,本试验沙棘多糖浓度在0.1和4 mg/mL时抑制自发性脂质过氧化作用抑制率分别为30.29%和57.60%。说明沙棘多糖抑制Fe2+-VC体外诱导小鼠肝脏脂质过氧化作用强于青钱柳多糖。

表4 沙棘多糖对Fe2+-VC 体外诱导小鼠肝脏 脂质过氧化抑制作用Table 4 Inhibitory effect of seabuckthorn polysaccharide on hepatic lipid peroxidation induced

3 结论

本试验结果表明在一定浓度范围内,沙棘多糖对DPPH自由基、OH自由基和超氧阴离子自由基都具有一定的清除能力,其IC50值分别为1.55、1.23、8.31 mg/mL,沙棘多糖对DPPH自由基、OH自由基清除能力比较强,对超氧阴离子自由基清除能力较弱。当沙棘多糖在浓度为2 mg/mL时,还原能力稍高于同浓度VC。表明沙棘多糖具有良好的抗氧化活性。通过建立4种肝匀浆体外模型来模拟人体内环境,以VC为阳性对照与沙棘多糖组进行对比,沙棘多糖与VC均能抑制小鼠肝匀浆脂质过氧化物的生成,沙棘多糖对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化及 CCl4、H2O2、Fe2+-VC所诱导的肝脏脂质过氧化均具有抑制作用,其IC50值分别为1.10、1.59、9.13、1.39 mg/mL。试验结果表明沙棘多糖拥有抗脂质过氧化的作用。本试验结果为沙棘多糖生物活性成分在食品和医药领域进一步开发为抗氧化剂提供理论依据。