白肉番石榴总黄酮提取工艺优化及体外抗氧化活性分析

张婉君,冯 彬,谢笔钧,孙智达

(华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070)

番石榴(PsidiumguajavaL.),又称为芭乐,俗名鸡矢果、拨子,是一种热带水果。原产于美洲热带,现在在全球广泛分布,全球最大的生产国家是印度,其次是中国和泰国。根据果肉的颜色可以将其分为红肉及白肉番石榴两大类。红肉番石榴多为野生,白肉番石榴为人工选育栽培的新品种。其中珍珠番石榴更是白肉番石榴中的优等品种,是支持南方农业经济的大宗水果之一[1]。根据我国药典记载,番石榴叶、皮具有开胃消食、止泻通便、收敛、止痒、提高机体免疫力、消炎、治疗糖尿病、保肝护肝等多重功效[2]。研究发现番石榴中含有维生素A、B、C以及钙、磷、钾、铁等元素[3-5]。番石榴中还含有多种活性成分,主要有黄酮、类胡萝卜素、挥发油、萜类和三萜等。其中黄酮是番石榴中重要的生物活性成分,具有良好的抑菌、抗氧化、抗肿瘤等功效。

目前对番石榴黄酮研究主要集中在红肉品种的叶及全果上,关于白肉品种番石榴研究较少。且研究局限于番石榴的单一部位,对于番石榴不同部位的黄酮提取及抗氧化活性的比较几乎为零,而使皮、果肉等其他部位黄酮物质被忽略[6-8]。

因此,本研究将选用珍珠番石榴(白肉)为原料,而其中番石榴叶及番石榴皮为工业生产的副产物,并且黄酮含量较高,具有进行提取工艺优化的价值,则对番石榴叶、皮中的总黄酮进行提取工艺优化。再对番石榴果肉总黄酮进行提取,探讨番石榴叶、皮、果肉中黄酮的体外抗氧化活性差异,以增加番石榴不同组成部分的综合利用价值,同时为开发天然的抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

珍珠番石榴(白肉) 购自广东珠海;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、水溶性维生素C Sigma公司;芦丁等 国产分析纯。

EL104电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UV2100紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司;DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;KX-100型高速多功能粉碎机 浙江武义鼎藏日用金属制品厂;5084高速冷冻离心机 德国艾本德。

1.2 实验方法

1.2.1 番石榴总黄酮的提取 番石榴叶的预处理:将番石榴叶置于温度为40 ℃的烘箱中烘干直至恒重,粉碎至60目于干燥器内保存。番石榴果皮的预处理:将番石榴的果皮使用液氮低温研磨成粉放置在-20 ℃下保存。分别准确称取1.0 g番石榴叶、皮粉末,按照一定的料液比加入一定浓度的乙醇溶液,在一定的设定温度下水浴浸提一定的时间。常温条件下以5000 r/min离心5 min,收集上清液,使用一定体积分数的乙醇溶液定容至50 mL棕色容量瓶中。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响 设定料液比为1∶5 (g/mL),提取温度为40 ℃,提取时间为60 min,考察乙醇浓度为20%、40%、60%、80%、100%时对番石榴叶、皮总黄酮提取量的影响。

1.2.2.2 提取温度对总黄酮提取量的影响 设定乙醇浓度为60%,料液比为1∶5 (g/mL),提取时间为60 min,考察提取温度为40、50、60、70、80 ℃时对番石榴叶、皮总黄酮提取量的影响。

1.2.2.3 料液比对总黄酮提取量的影响 设定乙醇浓度为60%,提取温度为60 ℃,提取时间为60 min,考察料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)对番石榴叶总黄酮提取量的影响。

设定乙醇浓度为60%,提取温度为50 ℃,提取时间为60 min,考察料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)对番石榴皮总黄酮提取量的影响。

1.2.2.4 提取时间对总黄酮提取量的影响 设定乙醇浓度为60%,料液比为1∶20 (g/mL),提取温度为60 ℃,考察提取时间为60、90、120、150、180 min对番石榴叶总黄酮提取量的影响。

设定乙醇浓度为60%,料液比为1∶10 (g/mL),提取温度为50 ℃,考察提取时间为60、90、120、150、180 min对番石榴皮总黄酮提取量的影响。

1.2.3 正交实验 根据单因素实验结果,进行正交试验设计,优化番石榴叶、皮黄酮的提取工艺。

表1 番石榴叶总黄酮正交实验因素水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal test of total flavonoids from guava leaves

表2 番石榴皮黄酮正交实验因素水平设计Table 2 Factors and levels of orthogonal test of total flavonoids from guava peel

1.2.4 总黄酮含量的测定 采用硝酸铝比色法测定总黄酮含量[9]。吸取0.8 mL番石榴叶、皮总黄酮提取液于10 mL具塞试管中,加入0.4 mL 5% NaNO2,混匀后常温放置5 min,再加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3,混匀常温放置5 min,后加入2 mL 4%的NaOH,混匀常温放置10 min后用70%乙醇溶液定容至5 mL。于510 nm处测定吸光值。另以0.2～0.8 mg/mL的芦丁标准液代替样品绘制标准曲线,线性回归方程为:y=0.8126x-0.0037(R2=0.9998),根据标准曲线计算得到番石榴叶、皮中总黄酮含量(mg/mL)。

1.2.5 黄酮提取量的计算 根据以下公式计算番石榴叶、皮总黄酮的提取量。

式中:C为根据标准曲线计算出的黄酮的质量浓度(mg/mL);V1为测定时的定容体积(mL);V2为提取液定容体积(mL);M为称取的样品质量(g);V0为用于测定的提取液体积(mL)。

1.2.6 番石榴叶、皮、果肉总黄酮体外抗氧化活性测定 根据单因素正交结果得出的最优总黄酮提取条件分别对番石榴叶、皮中的总黄酮进行提取。参照番石榴皮的处理及总黄酮的提取方式对番石榴果肉进行预处理并对总黄酮进行提取。使用体积分数为60%、50%、50%的乙醇溶液分别对番石榴叶、皮、果肉总黄酮溶液进行稀释,得到不同浓度的黄酮提取液。

1.2.6.1 清除ABTS自由基能力的测定 参照白海娜等的方法,并作部分修改[10]。ABTS原液可与过硫酸钾溶液反应生成ABTS+·,供氢抗氧化剂具有清除ABTS+·的作用。分别取0.2 mL不同浓度的番石榴叶、皮、果肉黄酮溶液与2.4 mL ABTS+·工作液混合避光反应10 min,在734 nm处测定吸光度。空白组以样品溶剂(70%乙醇)代替样品液,对照组以蒸馏水代替ABTS+·工作液。并以VC作为参照比较效果。按以下公式计算ABTS+·清除率:

式中:A-样品组吸光值;A0-空白组吸光值;A1-对照组吸光值。

ABTS+·工作液的获取:将7 mmol/mL的ABTS原液与2.45 mmol/mL的过硫酸钾溶液等体积混合,常温避光反应12～16 h。使用前用蒸馏水稀释ABTS+·溶液使其在734 nm处的吸光值为0.70±0.02,得到ABTS+·工作液。

1.2.6.2 清除羟基自由基能力的测定 当H2O2与FeSO4混合反应,会产生·OH。水杨酸的加入可结合·OH产生在510 nm处有特殊吸收的2,3-二羟基苯甲酸。若向以上反应体系中加入具有清除羟基自由基的抗氧化剂,就会减少有色化合物的产生,降低体系吸光值[11]。本实验利用以上原理使用水杨酸法评估样品清除羟基自由基的能力并与VC对比。在10 mL具塞试管中分别加入2 mL不同浓度的番石榴叶、皮、果肉黄酮溶液,然后加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液,再与2 mL 6 mmol/L的H2O2混合,摇匀常温静置10 min。之后加入6 mmol/L的水杨酸溶液2 mL,摇匀常温静置30 min。于510 nm处测定吸光值。空白组以样品溶剂代替样品溶液。对照组以蒸馏水代替H2O2。按以下公式计算羟基自由基清除率:

式中:A-样品组吸光值;A0-空白组吸光值;A1-对照组吸光值。

1.2.6.3 铁还原能力的测定 抗氧化剂可将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾,亚铁氰化钾再与三氯化铁反应可产生普鲁士蓝(Fe4[Fe(CN)6]3),此物质在700 nm处有最大吸收[12]。因此可通过以上反应原理测定样品的还原能力大小,并以VC为参照比较效果。分别取2.5 mL不同浓度的番石榴叶、皮、果肉黄酮溶液与2.5 mL的磷酸缓冲液(NaH2PO4与Na2HPO4,0.2 mol/L,pH=6.6)混合,并加入2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液,充分混匀后在50 ℃条件下水浴20 min,快速冷却后加入2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应,常温条件下以3000 r/min离心10 min,取1 mL上清液与0.5 mL 1%的三氯化铁溶液混合,常温静置10 min后于700 nm处测定吸光值,吸光值越高样品的还原能力越强。

1.2.6.4 总抗氧化能力的测定 本实验使用磷钼络合法测定样品的总抗氧化能力[13]。Mo(VI)在抗氧化剂存在的情况上可将其还原为Mo(V)产生在695 nm处具有最大吸收的绿色化合物(磷钼化合物)。因此可通对其吸光度的差异来对比样品的抗氧化性强弱,并与VC作比较。向具塞试管中加入1.0 mL 3.0 mol/L的H2SO4溶液、1.0 mL的0.14 mol/L的Na3PO4溶液和1 mL 0.02 mol/L的钼酸铵溶液,充分混匀后分别加入1 mL不同浓度的番石榴叶、皮、果肉黄酮溶液,用蒸馏水定容至5 mL。加塞后于90 ℃下水浴90 min。取出冷却于695 nm处测定吸光度。

1.3 数据处理

实验结果均表示为平均值±标准差,使用SPASS 18.0软件进行显著性分析,Origin 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对番石榴叶、皮中总黄酮提取量的影响 由图1可知,当乙醇浓度逐渐升高时,番石榴叶及番石榴皮中的总黄酮提取量逐渐升高。当乙醇浓度到达60%时,番石榴叶及番石榴皮中总黄酮的提取量达到最高,分别为(72.41±2.34)、(39.49±0.53) mg/g。随后乙醇浓度继续增加,番石榴叶及番石榴皮中总黄酮提取量反而降低。这可能是由于乙醇浓度影响了黄酮类及其他醇溶性物质的溶解性,在乙醇浓度为60%时,黄酮类物质的溶出量达到最大并达到饱和,当乙醇浓度再增大时,会使得其他醇溶物的溶出量也增加[14]。因此,番石榴叶、皮总黄酮的提取中乙醇提取分数选择60%。

图1 乙醇浓度对黄酮提取量的影响

2.1.2 提取温度对总黄酮提取量的影响 由图2可知,番石榴叶中总黄酮的提取量随着提取温度的升高而升高,在温度达到60 ℃时,总黄酮提取量达到最大(112.11±1.39) mg/g。当提取温度继续升高,番石榴叶中总黄酮提取量反而降低。这可能是由于温度过高时黄酮因氧化被破坏[15]。因此,番石榴叶中总黄酮的提取温度选择60 ℃。同理分析可知,在提取温度为50 ℃,番石榴皮中总黄酮提取量达到最大(46.38±0.21) mg/g。番石榴皮总黄酮提取温度应选择50 ℃。

图2 提取温度对总黄酮提取量的影响

2.1.3 料液比对总黄酮提取量的影响 由图3可知,随着提取料液比的增加,番石榴叶中总黄酮的提取量也增加,当料液比为1∶20 (g/mL)时,番石榴叶总黄酮提取量达到最大(166.96±4.40) mg/g。再继续加大提取料液比,番石榴叶中总黄酮的提取量降低。在料液比为一个合适范围时,随料液比的增加会促进黄酮物质的溶出,而料液比过高时,会加大其他杂质的溶出,使得黄酮提取量降低[14,16]。因此,番石榴叶中总黄酮提取的料液比选择1∶20 (g/mL)。同理,当提取料液比为1∶10 (g/mL)时,番石榴皮中总黄酮提取量达到最大(53.46±1.11) mg/g,因此番石榴皮总黄酮提取料液比应选择1∶10 (g/mL)。

图3 料液比对总黄酮提取量的影响

2.1.4 浸提时间对总黄酮提取量的影响 由图4可知,随着提取时间的延长,番石榴叶中的总黄酮溶出量也逐渐加大,当提取时间在150 min时,番石榴叶总黄酮含量达到最大(181.43±0.75) mg/g。再延长提取时间,总黄酮含量则呈下降趋势。这可能是由于当提取时间过长时会使黄酮类物质分解或者使得其他杂质溶出增多[17]。因此,番石榴叶总黄酮提取的时间选择150 min。同理,当提取时间为90 min时,番石榴皮中总黄酮提取量达到最大(49.97±1.14) mg/g。番石榴皮中总黄酮提取时间应选择90 min。

图4 提取时间对总黄酮提取量的影响

2.2 正交实验结果

根据单因素的结果,设计四因素三水平正交试验,番石榴叶试验结果见表3,由R值分析可知,四因素对番石榴叶总黄酮提取量的影响大小为A>C>B>D,即乙醇浓度>料液比>提取温度>提取时间。根据k值分析可得番石榴叶总黄酮最优提取工艺组合A1B3C2D1。即乙醇浓度为50%,提取温度为65 ℃,料液比为1∶20 (g/mL),提取时间为135 min。按以上理论最优工艺进行提取,番石榴叶总黄酮提取量为(188.66±0.23) mg/g,显著高于正交表中9个组合的番石榴叶总黄酮提取量(p<0.05)。

番石榴皮总黄酮的提取结果见表4,四因素对番石榴皮总黄酮提取量影响大小为A>B>C>D。其最佳工艺组合为A2B1C1D3,即乙醇浓度为60%,提取温度为45 ℃,料液比为1∶7 (g/mL),提取时间为105 min。按照以上理论最优工艺进行提取,番石榴皮总黄酮提取量为(48.03±0.16)mg/g,显著高于正交表中9个组合的番石榴皮总黄酮提取量(p<0.05)。番石榴叶及番石榴皮总黄酮的提取工艺均得以验证。

表4 番石榴皮总黄酮正交实验设计及结果Table 4 Orthogonal test design and result of total flavonoids from guava peel

因番石榴果肉与番石榴果皮连接较为紧密,且其生长周期及所处环境等条件较番石榴叶来说更为相近。所以在提取番石榴果肉黄酮时采用的是番石榴皮黄酮提取最佳工艺条件。其中番石榴果肉在此提取条件下的黄酮提取量10.65 mg/g,远低于番石榴叶及皮的黄酮提取量,因此本文对番石榴果肉黄酮的提取工艺不作探讨。而用番石榴皮黄酮的最佳工艺条件进行提取,目的是下一步探讨番石榴叶、皮、果肉黄酮的体外抗氧化能力。

2.3 番石榴叶、皮、果肉中总黄酮的体外抗氧化活性评价

2.3.1 对ABTS+·的清除作用 番石榴叶、皮、果肉黄酮对ABTS+·的清除作用如图5所示。随着样品浓度的增加,对ABTS+·清除率也随之升高,在样品浓度为0.05 mg/mL时,番石榴叶、皮、果肉黄酮对ABTS+·清除率分别高达84.30%±0.12%、60.87%±0.26%、50.70%±0.12%。相同浓度下(0.02～0.05) mg/mL比较,三种黄酮样品对ABTS+·清除能力均为番石榴叶黄酮>番石榴皮黄酮>番石榴果肉黄酮,并存在显著性差异(p<0.05)。与阳性对照VC相比,番石榴叶黄酮对ABTS+·的清除率显著高于VC(p<0.05),而VC又显著优于番石榴皮及果肉黄酮。三种黄酮浓度与ABTS+·清除率呈现良好的剂量效应关系。

图5 番石榴叶、皮、果肉黄酮浓度对ABTS+·的清除作用

2.3.2 对·OH的清除作用 番石榴叶、皮、果肉黄酮对·OH的清除作用如图6所示。在0.2～1.6 mg/mL范围内,·OH清除率随番石榴叶黄酮浓度的增加而增加,在其浓度为1.6 mg/mL时,对·OH清除率为(76.55±0.05) mg/mL,随浓度继续增高,清除率未有显著性增长。当番石榴皮、果肉黄酮浓度逐渐升高时,·OH的清除率也随之增高。且阳性对照VC对·OH的清除能力显著高于番石榴叶、皮、果肉黄酮(p<0.05)。四者间清除·OH能力排序为VC>番石榴叶黄酮>番石榴皮黄酮>番石榴果肉黄酮。

图6 番石榴叶、皮、果肉黄酮浓度对·OH清除作用的影响

2.3.3 铁还原力分析 番石榴叶、皮、果肉黄酮的铁还原力如图7所示。在铁还原力测定实验中,吸光值越大,代表铁还原力越强[18-19]。随着样品浓度的增加,三种黄酮还原力逐渐提高,并呈现明显的剂量效应关系。当样品浓度为0.06 mg/mL时,番石榴叶、皮、果肉黄酮及VC样品对应的吸光值为1.33±0.01、0.86±0.02、0.79±0.03、1.69±0.03。三种黄酮样品及VC还原力强弱排序为VC>番石榴叶黄酮>番石榴皮黄酮>番石榴果肉黄酮,并且样品间还原力强弱具有显著性差异(p<0.05)。

图7 番石榴叶、皮、果肉黄酮浓度对铁还原力的影响

2.3.4 总抗氧化能力分析 番石榴叶、皮、果肉黄酮的总抗氧化能力如图8所示。在总抗氧化能力测定实验中,吸光值越高,抗氧化力越强[20-21]。番石榴叶、皮、果肉黄酮随浓度的增加抗氧化能力也逐渐增加。比较相同样品浓度作用下的吸光值,可知三种黄酮的总抗氧化能力强弱顺序为番石榴叶黄酮>番石榴皮黄酮>番石榴果肉黄酮,且这三种黄酮的浓度均与抗氧化能力间存在良好的剂量效应关系。在样品浓度范围为0.02～0.05 mg/mL时,番石榴叶、皮黄酮的总抗氧化能力均优于VC,番石榴果肉黄酮总抗氧化力略低于VC。当样品的浓度为0.06 mg/mL时,VC组对应吸光值高于番石榴皮黄酮组,与低浓度范围(0.02～0.05) mg/mL所得规律不同,这可能与样品浓度有关,还需进一步探究。

图8 番石榴叶、皮、果肉黄酮浓度对总抗氧化能力对影响

番石榴叶、皮、果肉黄酮对ABTS+·及·OH均具有良好的清除作用,也具有较好的铁还原能力及总抗氧化能力。综合以上抗氧化实验结果,可知三种黄酮的体外抗氧化能力强弱为番石榴叶黄酮>番石榴皮黄酮>番石榴果肉黄酮。可能是由于番石榴叶与番石榴果皮、果肉中黄酮组分及含量存在差异,从而影响了其抗氧化活性。而对于番石榴皮黄酮与番石榴果肉黄酮来说,尽管两者采用相同的提取工艺,但原料本身黄酮组分可能存在不同,所以产生了抗氧化活性的差别。

3 结论

番石榴叶叶、皮为番石榴工业应用中的副产物,具有对其总黄酮提取工艺优化价值。因此本实验采用有机溶剂浸提法对珍珠番石榴(白肉)叶、皮黄酮的提取工艺进行了优化对比。番石榴叶黄酮最佳提取工艺为:乙醇浓度50%、提取温度为65 ℃,料液比为1∶20 (g/mL),提取时间为135 min。番石榴皮黄酮最佳提取工艺为乙醇浓度60%、提取温度为45 ℃,料液比为1∶7 (g/mL),提取时间为105 min。在最优工艺条件下,番石榴叶、皮黄酮的提取量分别为(188.66±0.23)、(48.03±0.16) mg/g。通过ABTS+·清除实验、·OH基清除实验、铁还原力的测定及总抗氧化能力的测定,发现三种黄酮样品的体外抗氧化能力大小为番石榴叶黄酮>番石榴皮黄酮>番石榴果肉黄酮。且番石榴叶黄酮在ABTS+·清除能力及总抗氧化能力上显著优于阳性对照VC。由此可见,白肉番石榴黄酮可作为良好的抗氧化剂的天然来源。