木犀草素固体分散体的制备和优化

吴 春,陈金慧

(哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150076)

木犀草素是一种极具代表性的黄酮类化合物,在自然界分布广泛[1]。具有抗氧化、消炎、抗癌、增强免疫、抗肿瘤、镇咳、祛痰、保护神经系统等多种生理功能[2-4],木犀草素曾被报道可用于食品防腐[5],更被国外确认为是一种法律允许的食品色素[6],其丰富的生理功能吸引了众多学者的研究及重视,但其水溶性差的缺点在很大程度上限制了它的应用。

固体分散体(SD)是指原料(粒径0.001～0.1 μm)以一定状态均匀分散于载体中形成的一种分散体系,具有明显改善难溶性原料的溶出速率与溶解度、提高活性物质的生物利用度或减少不良反应、实现复方多组分的同步释放、延缓活性物质的水解和氧化、掩盖不良气味、提高原料的稳定性的优点,且制备方法较为简便[7]。本研究选择将木犀草素制备为目前尚无报道的木犀草素固体分散体,并采用响应曲面分析法优化其最佳制备工艺,以改善木犀草素的水溶性,提高其生物利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木犀草素(98%) 宁波德康生物制品有限公司;大豆卵磷脂(98%)、PVP K30(99%) 天津市光复精细化工研究所;无水乙醇(分析纯) 天津市百世化工有限公司;三氯甲烷(分析纯) 上海浦顺进出口有限公司;异丙酮(分析纯) 天津市新精细化工开发中心。

FA2004N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司;UV-5100B型紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;HZS-H型恒温水浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学有限公司;HH.S11-2数显式恒温水浴锅 天津市欧诺仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 木犀草素固体分散体的制备 将一定量的木犀草素溶于无水乙醇,充分溶解后形成澄清透明的乙醇相溶液。另取适量比例的载体PVP K30于水浴锅充分熔融。再将乙醇相溶液与PVP K30混合,通过磁力搅拌将木犀草素、PVP K30、无水乙醇充分融合。水浴蒸发除去无水乙醇后,真空干燥得到微黄色固体,即为木犀草素固体分散体[8-9]。

1.2.2 标准曲线的绘制 精确称取0.005 g 木犀草素标准品,以无水乙醇定容于50 mL容量瓶,摇匀,准确吸取该木犀草素-乙醇标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL,无水乙醇定容至10 mL,得到系列浓度梯度的木犀草素工作液。以无水乙醇作为空白样,于353 nm(木犀草素的最大吸收波长)处分别测OD值绘制标准曲线。

1.2.3 累积溶出度的测定 室温下,将磁力搅拌器转速调整至100 r/min,以蒸馏水为溶出介质(溶出介质温度恒定在37±5 ℃)。取木犀草素固体分散体置于溶出杯中,接触介质溶出时开始转动并记录时间,分别于5、10、15、20、25、30 min时取样10 mL(并及时补加10 mL等温蒸馏水),经0.45 μm微孔滤膜滤过,取澄清滤液,于353 nm波长处测定吸光度,结合公式与标准曲线回归方程,求得累积溶出度,并绘制溶出曲线。

式(1)

式(2)

式中:n:溶出木犀草素的总物质的量,mol;m:木犀草素固体分散体的投入量,mg;V为溶出介质体积,mL;Ci为取样时间点处木犀草素的浓度,mg/mL;Vi为取样体积,mL。

1.2.4 载体的选择 在其他制备因素相同的条件下(原料用量35 mg、原料-载体质量比3∶1、乙醇体积分数50%、制备时间20 min、制备温度50 ℃),分别以PVP K30、PEG 6000、PEG 8000、PEG 10000为载体,制备木犀草素固体分散体,测定并计算其累积溶出度。

1.2.4.1 单因素实验 以累积溶出度为评价指标,通过测定木犀草素在不同溶出时间下的溶出度,分别考察原料用量、载体与原料比例(质量比)、乙醇体积分数、制备时间及制备温度对固体分散体溶出度的影响,确定最佳制备工艺。

1.2.4.2 最佳原料用量的确定 以PVP K30为载体,在载体与原料比例3∶1、无水乙醇、制备时间30 min、制备温度60 ℃的条件下,分别制备木犀草素用量30、35、40、45、50 mg的固体分散体,测定并计算其累积溶出度。

1.2.4.3 最佳载体与原料比例的确定 以PVP K30为载体,在原料用量40 mg、无水乙醇、制备时间30 min、制备温度60 ℃的条件下,分别制备载体与原料比例1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1的固体分散体,测定并计算其累积溶出度。

1.2.4.4 乙醇体积分数的确定 以PVP K30为载体,在原料用量40 mg、载体与原料比例7∶1、制备时间30 min、制备温度60 ℃的条件下,分别制备乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%的固体分散体,测定并计算其累积溶出度。

1.2.4.5 最佳制备时间的确定 以PVP K30为载体,在原料用量40 mg、载体与原料比例7∶1、乙醇体积分数80%、制备温度为60 ℃的条件下,分别制备反应时间20、25、30、35、40 min的固体分散体,测定并计算其累积溶出度。

1.2.4.6 最佳制备温度的确定 以PVP K30为载体,在原料用量40 mg、载体与原料比例7∶1、乙醇体积分数80%、制备时间为30 min的条件下,分别制备反应温度50、60、70、80、90 ℃的固体分散体,测定并计算其累积溶出度。

1.2.5 Box-Behnken响应面优化实验 根据单因素实验及Box-Behnken中心组合设计原理,选取原料用量、载体与原料比例、制备时间、制备温度四个单因素与木犀草素固体分散体累积溶出度进行响应面优化设计实验。Box-Behnken试验因素水平见表1[10-11]。

表1 响应曲面因素水平表Table 1 Analytical factors and levels of response surface methodology

1.3 数据处理

每次实验重复操作三次,取平均值,计算标准误差并制图分析。根据Design-Expert 8.05b软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以木犀草素标准品浓度(μg/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程y=0.0414x+0.0511,相关系数R2=0.999。

图1 木犀草素标准曲线

2.2 载体的选择

由图2可见,载体种类对固体分散体的累积溶出度的影响较大,累积溶出度从大到小的顺序依次为:PVP K30>PEG 10000>PEG 8000>PEG 6000,其中,以PEG为载体时,相对分子质量较高的载体更利于固体分散体的溶出,但三者效果均弱于PVP K30,故本实验选择PVP K30作载体制备木犀草素固体分散体。

图2 不同载体对累积溶出度的影响

2.3 单因素实验结果

2.3.1 原料用量对累积溶出度的影响 由图3中的累积溶出度曲线可见,五条梯度曲线在0～5 min时上升趋势较快,5 min后,溶出的速率较为平缓,说明载体包被的原料在5 min内的溶出量较大,5 min之后剩余的原料渐渐从体系中溶出。随着木犀草素用量的增加,木犀草素固体分散体的累积溶出度差异较大。原料用量为30 mg时,木犀草素固体分散体在30 min的累积溶出度为37.28%,当木犀草素用量为40 mg时,30 min的累积溶出度达到最大值54.01%,根据累积溶出度,选择原料用量35～45 mg作为响应曲面实验参数范围。

图3 木犀草素用量对累积溶出度的影响

2.3.2 载体与原料比例对累积溶出度的影响 由图4中的累积溶出度曲线可见,载体与原料比例的变化对木犀草素固体分散体的溶出度有明显影响。当载体与原料比例为1∶1时,木犀草素固体分散体在30 min的累积溶出度为33.07%,随着载体在体系中所占比例的增加,当载体与原料比例为7∶1时,溶出度达最佳状态,继续增加载体在体系中所占比例时,溶出度呈下降趋势,可能是由于木犀草素已能够充分分散在载体中,且当载体在体系中所占比例过高时，有效作用被削弱,根据实验结果,选择载体与原料比例5∶1～9∶1作为响应曲面实验参数范围。

图4 载体与原料比例对累积溶出度的影响

2.3.3 乙醇体积分数对累积溶出度的影响 由图5中的累积溶出度曲线可见,乙醇体积分数的变化对木犀草素固体分散体溶出度的影响较小,但仍可看出,随着体积分数的增加,溶出度呈现先增加后下降的趋势,当乙醇体积分数为80%时,溶出度达到最佳状态。故选择体积分数80%的乙醇进行实验。

图5 乙醇体积分数对累积溶出度的影响

2.3.4 制备时间对累积溶出度的影响 由图6中的累积溶出度曲线可见,随着制备时间的增长,木犀草素固体分散体的溶出度呈现先增加后降低的趋势。当制备时间为30 min时,溶出度达到最大值,继续增加制备时间,溶出度开始下降,表明当制备时间为30 min时,木犀草素与载体已能够达到充分反应的状态,继续增加制备时间使原料与载体之间的平衡状态受到破坏,导致溶出度下降。因此,根据累积溶出度,选择制备时间25～35 min作为响应曲面实验参数范围。

图6 制备时间对累积溶出度的影响

2.3.5 制备温度对累积溶出度的影响 由图7中的累积溶出度曲线可见,随着制备温度的升高,木犀草素固体分散体的累积溶出度随之增大,温度过低不利于木犀草素固体分散体的制备,当制备温度升高至70 ℃时累积溶出度达到最佳值,继续升高制备温度,体系中的乙醇损失过快,固体分散体的制备受到影响,累积溶出度呈下降趋势。因此,根据累积溶出度,选择制备温度60～80 ℃作为响应曲面实验参数范围。

图7 制备温度对累积溶出度的影响

2.4 响应曲面实验结果分析

2.4.1 响应面实验数据 以单因素实验结果为基础,根据 Box-Behnken 中心组合实验设计原理,选择以原料用量、载体与原料比例、制备温度、制备时间为主要影响因素,以木犀草素固体分散体的累积溶出度为响应值(Y),设计四因素三水平(共29个实验点)的响应面分析实验。实验方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验方案及响应值Table 2 Box-Behnken test scheme and response value

利用Design Expert 软件,对表2中木犀草素固体分散体累积溶出度的数据进行多元回归拟合,得到回归方程:Y(%)=83.71-1.40A+2.56B+1.56C1.00D-1.45AB-2.90AC-2.33AD+2.60BC+3.51BD-1.33CD-9.67A2-16.59B2-6.52C2-7.25D2

表3 回归模型的方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

2.4.2 响应面分析 根据响应曲面软件分析得到的具有一定显著性的各因素的响应面图以及等高线图见图8。响应面图是响应值对各实验因素所构成的三维空间曲面图,可直观的反应各因素的交互作用[15]。如果一个响应曲面坡度相对平缓,表明其可以忍受处理条件的变异,而不影响到响应值的大小相反,如果一个响应曲面坡爬非常陡峭,表明响应值对于处理条件的改变非常敏感[16]。由等高线中心位置向边缘延伸,表示累积溶出度逐渐降低,中心位置表示累积溶出度最高。分析图8e可得出,载体与原料比例与制备温度的交互作用显著,且载体与原料比例曲面坡度较陡峭,固定其他因素不变,改变载体与原料比例对累计溶出度的影响更大,同理,固定其他因素不变,改变载体与原料比例对累计溶出度的影响比改变原料用量及制备温度大,与二元回归方程系数相吻合。等高线的形状越趋于圆形,表明两因素的交互作用不显著,越趋于椭圆形,则交互作用越显著,趋于椭圆形,且椭圆与两轴之间形成一定的角度,则交互作用高度显著[17-19],分析上述响应面,各交互作用等高线图均趋于椭圆形,因此交互作用极显著,各交互作用的等高线图均不与两轴成一定角度,因此不存在交互作用高度显著项,这与方差表结果一致。

图8 各因素交互作用响应面及等高线

2.5 验证实验

通过软件分析及拟合方程计算得到最佳实验条件为:原料用量39.43 mg,载体与原料比例3∶20,制备时间30.78 min,制备温度70.98 ℃,此时溶出度达86.10%。考虑到实际操作的便利性,将最佳实验参数修正为:原料用量39.5 mg、载体与原料比例7∶1,制备时间31 min,制备温度80 ℃,进行三次平行试验,最终得到溶出率为84.72%。

3 结论

木犀草素具备黄酮类化合物的一系列生物活性,在食品及药学领域均有着广泛的开发利用前景,本研究针对木犀草素水溶性差的缺点,将其进行改性并以优化木犀草素固体分散体制备条件为目的,通过响应面分析得到最佳工艺参数:原料用量39.5 mg、载体与原料比例7∶1,制备时间31 min,制备温度80 ℃,此条件下制备的木犀草素固体分散体的累积溶出度达84.72%。目前,尚鲜有关于木犀草素固体分散体的相关报道,本文的实验结果可为木犀草素在更多领域的开发及利用提供可行性依据。