复合乳酸菌发酵枸杞汁的工艺优化

王 茹,方海田,*,刘慧燕,马若霜,刘予煊,李金娜,赵贝贝,周 婷,魏姗姗,安广颖

(1.宁夏大学，宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室,宁夏银川 750021;2.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

枸杞(Lyciumbarbarum),也称枸杞子,属茄科枸杞的成熟果实,是我国重要的特色药用植物资源之一,分布在我国宁夏、新疆、青海和甘肃等地[1]。枸杞主要成分有枸杞多糖、甜菜碱、枸杞色素、黄酮、蛋白质、游离氨基酸、维生素E和维生素C等[2-3],具有增强人体免疫力、降低胆固醇、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等方面的药理作用[4-5]。

植物乳杆菌和肠膜明串珠菌是食品中常用的乳酸菌[6-10],膜明串珠菌又称风味菌、香气菌和产香菌,和植物乳杆菌肠同为革兰氏阳性菌[11]。有研究表明,肠膜明串珠菌和植物乳杆菌进行混合发酵会得到风味和品质更好的产品[12-14]。汪敏[12]利用肠膜明串珠菌和植物乳杆菌对辣椒进行发酵,研究发现混合菌株发酵的产品风味明显优于单菌株发酵。李秀秀等[15]按照石榴枸杞果汁体积比2∶1,酵母量3%,发酵时间6 d,发酵温度28 ℃的配方发酵石榴枸杞酒;成堃等[16]利用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌(1∶1)研究虫草枸杞风味酸奶的工艺。严倩云等[17]以枸杞和玛咖水提物残渣为原料,37 ℃发酵24 h,生产酵素产品。虽然上述以枸杞为原料的加工工艺研究不少,但用乳酸菌直接发酵枸杞汁的工艺较少,且大多发酵过程太慢,生长周期长,会提高产品的成本。为了缩短发酵周期,降低生产成本,拓展枸杞产品的开发和生产。

因此,本论文以枸杞干果为主要原料,将其破碎取汁后接入肠膜明串珠菌和植物乳杆菌进行混合发酵,旨在开发一种富含功能因子的发酵枸杞汁,为益生菌在发酵枸杞汁方面的应用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞、白砂糖、小苏打 市售;异抗坏血酸钠 特正商贸有限公司;植物乳杆菌、肠膜明串珠菌 宁夏大学农学院生物实验室保存;MRS培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;考马斯亮蓝G-20、牛血清蛋白、芦丁、苯酚、浓硫酸、葡萄糖 均为分析纯,北京索莱宝科技有限公司。

RZ-988eRoyalstar打浆机 合肥荣事达小家电公司;PB-LO pH计 赛多利斯科学仪器有限公司;PLD-HDE2.0手持糖量计 陕西普洛帝测控技术有限公司;V-5100紫外分光光度计 上海精科实业有限公司;SBA-40E生物传感分析仪 山东省科学院研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的活化与扩大培养 将保存于甘油中的肠膜明串珠菌和植物乳杆菌分别接入MRS斜面培养基上,37 ℃恒温培养8～10 h后取出,重复3次,使其充分活化。

将挑取一环斜面培养基上生长较好的单菌落,接种至MRS液体培养基中,37 ℃恒温培养8～10 h后取出,震荡摇匀后,按照接种量1%转接于100 mL三角瓶中进行扩大培养(37 ℃,8～10 h),得到肠膜明串珠菌和植物乳杆菌菌悬液,备用。

1.2.2 发酵枸杞汁制备工艺 挑选肉厚,无腐烂的中宁枸杞,用流动水多次冲洗枸杞表皮,洗掉黏在枸杞表面的污垢后,以1∶5 (m∶v)加水,浸泡8～9 h,加入护色剂(0.05%的异抗坏血酸钠),后打浆,用无菌纱布和漏斗过滤,得到枸杞汁。添加适量的小苏打调pH至6.5～7.0后,加入适量白砂糖后,采用巴氏杀菌法(65 ℃,25～35 min)进行杀菌。杀菌结束后,将制备好的菌液,按一定的接种比例接入枸杞汁中,放入37 ℃恒温培养箱中发酵一定时间,得到成品。

1.2.3 单因素试验 固定接种量5%,发酵时间为10 h,白砂糖加量5%,考察肠膜明串珠菌:植物乳杆菌不同体积比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)对枸杞汁中乳酸含量和感官评价的影响;固定肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌1∶1,发酵时间10 h,白砂糖加量5%,考察不同接种量(3%、4%、5%、6%、7%)对枸杞汁中乳酸含量和感官评价的影响;固定肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌1∶1,接种量5%,白砂糖加量5%,考察不同发酵时间(8、9、10、11、12 h)对枸杞汁中乳酸含量和感官评价的影响;固定肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌1∶1,接种量5%,发酵时间10 h,考察不同白砂糖加量(3%、4%、5%、6%、7%)对枸杞汁中乳酸含量和感官评价的影响,实验重复3次。

1.2.4 响应面优化 在单因素实验基础上,确定菌种比例、接种量、发酵时间、白砂糖加量4个因素的水平值,以感官评分为指标，运用Design-Expert 10.0.7软件进行Box-Behnken响应面设计和数据分析。具体实验因素与各水平值见表1,实验重复3次。

表1 枸杞发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Test factors and levels of optimization response surface of Lycium barbarum fermentation technology

1.2.5 乳酸含量的测定 采用生物传感分析仪直接测定。

1.2.6 感官评价 枸杞复合饮料加工后,请15位有丰富评定经验的专业人员组建感官评定小组,通过表2分别从色泽、滋味、协调性和组织状态对枸杞复合饮料进行综合评定,总分为100分,然后取其平均值作为评分结果。

表2 枸杞发酵饮料感官品质评分标准Table 2 Evaluation standard of sensory quality of Lycium barbarm juice

1.2.7 理化及微生物指标的测定 可溶性固形物测定:采用手持糖度计直接测定;pH的测定:采用精密pH计;蛋白质含量的测定:采用考马斯亮蓝G-250 法测定[18];总黄酮含量的测定:采用紫外分光光度法测定[19];总糖含量的测定:采用苯酚-浓硫酸法测定[20];乳酸菌菌落总数和致病菌的测定:采用GB 4789-2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》[21]。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2007及Design-Expert 10.0.7软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素结果

2.1.1 菌种比例对枸杞汁的影响 由图1可知,当肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌的比例为1∶3时,乳酸含量最高为349 mg/100 mL;当肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌的比例为1∶1时,感官评分最高90.12 分。植物乳杆菌代谢产生有机酸、过氧化氢、双乙酰等多种天然活性物质,具有维持肠道内菌群平衡,降低胆固醇水平,抑制肿瘤前体物质形成[22-25],提高机体免疫力等多种益生菌功能[26]。肠膜明串珠菌主要发酵蔗糖产生酸、葡聚糖[27]和甘露醇[28]等物质,并产生大量B族维生素,产生多种风味物质[29],大量的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢物[30],可以调节肠道菌群,抑制抗腐败菌[31]。由图可知,当肠膜明串珠菌比例越来越大时,乳酸逐渐降低,出现这种现象的原因可能是由于虽然肠膜明串珠菌和植物乳杆菌都是高产酸菌株,但和肠膜明串珠菌相比,植物乳杆菌产酸能力更强[32]。因此,根据乳酸含量和感官评分,择取菌种比例三个较优的水平分别为1∶2、1∶1、2∶1。

图1 菌种比例对枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响

2.1.2 接种量对枸杞汁的影响 由图2可知,发酵液中的乳酸含量随接种量的增加而呈先上升后逐渐平稳的趋势。在接种量为7%时,乳酸含量达到最大值为350 mg/100 mL,而在接种量为5%时,感官评分最高90.56分。在接种量为3%～5%范围内,乳酸含量增长最快,这可能是因为初始枸杞汁中的营养物质丰富,接种量越大,乳酸菌迅速利用营养物质进行发酵。但是,当接种量大于5%后,乳酸含量趋于平稳。这可能由于乳酸菌种间存在竞争,营养物质用于自身繁殖,一部分菌体在竞争中处于劣势而死亡。因而,接种量选择4%、5%、6%三个水平进行下一步实验。

2.1.3 发酵时间对枸杞汁的影响 由图3可知,发酵液中的乳酸含量随时间的延长逐渐增加,但增加的趋势越来越弱。当发酵12 h时,乳酸含量达到最大值349 mg/100 mL,当枸杞汁发酵10 h时,感官评分最高90.21分。在发酵8～10 h时,乳酸含量急剧增加,这可能是因为发酵初期,枸杞汁中的营养物质丰富,乳酸菌大量繁殖,不断消耗营养物质产生大量的乳酸。在发酵10 h时,延长发酵时间,乳酸含量逐渐趋于平稳。这是可能是因为枸杞汁中的营养物质不断消耗,乳酸含量不断增加,酸度上升,过酸的条件不利于乳酸菌的生长,使菌株的生长和代谢受到抑制。因而,选取发酵时间的三个较优的水平分别为9、10、11 h。

图3 发酵时间对枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响

2.1.4 白砂糖加量对枸杞汁的影响 由图4可知,发酵液中的乳酸含量随着白砂糖加量的增加而呈现先上升后下降的趋势。当白砂糖加量在5%的时候,乳酸含量达到最高,为340 mg/mL,当白砂糖加量为5%时,感官评分最高90.12分。当白砂糖加量在3%～4%时,乳酸含量比较低,这可能是因为碳源不充足,发酵不充分,当白砂糖加量大于5%时,乳酸含量都逐渐趋于平缓,可能是由于过高的碳源浓度导致发酵液渗透压升高,对微生物生长有轻微的抑制作用,导致微生物代谢减慢。综上所述,白砂糖加量选择4%、5%、6%三个水平进行下一步实验。

图4 白砂糖加量对枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响

2.2 响应面实验结果及数据分析

2.2.1 响应面实验设计方案及结果 在上述单因素试验基础上,利用Box-Behnken试验,以枸杞汁中乳酸含量和感官评分为响应值,以菌种比例(A)、接种量(B)、发酵时间(C)和白砂糖加量(D)为自变量,建立四因素三水平中心组合实验。

表中数据为3 组平行试验结果平均值。

2.2.2 回归方程拟合及方差分析 以乳酸含量为响应值,回归分析结果见表4,对各因素回归拟合后,得到回归方程为:

表4 以乳酸含量为响应值的回归模型及方差分析Table 4 Regression model and variance analysis based on lactic acid content

Y1(乳酸含量)=341.60+11.83A+10.42B+9.42C-3.17D+0.25AB-1.25AC+2.00AD-2.50BC-1.00BD-1.00CD-10.03A2-7.41B2-5.66C2-10.03D2

表5 以感官评分为响应值的回归模型及方差分析Table 5 Regression Model and Variance Analysis with sensory score as response value

该模型p<0.01,说明该模型极显著;失拟项p>0.05,说明没有产生失拟现象。R2为 0.9982,说明拟合度良好,方程的显著性及可靠性极高。各项方差分析表明,一次项A、B、C、D,交互项AD、BC,平方项A2、B2、C2、D2对乳酸含量有极显著影响(p<0.01)。根据F值大小可知,各因素对乳酸含量影响的主次因素为A>B>C>D,即菌种比例>接种量>发酵时间>白砂糖加量。对乳酸含量影响的交互项中,AD即菌种比例和白砂糖加量以及BC即接种量和发酵时间交互作用对乳酸含量的影响有极显著影响(p<0.01),其响应面图5。由于其他因素的交互作用对乳酸含量和感官评分的影响较小,所以未列出。

图5 菌种比例、接种量、发酵时间和白砂糖加量对乳酸含量影响的响应面

将感官评分作为响应值,回归分析结果见表5,得到模型的二次多项回归方程:

Y2(感官评分)=91.86+1.34A+0.85B+0.18C+1.72D-1.54AB+0.25AC+0.14AD-0.76BC-0.63BD+0.26CD-6.85A2-6.07B2-5.42C2-6.76D2

该模型p<0.01,说明该模型极显著;失拟项p>0.05,说明没有产生失拟现象。R2为0.9970,说明拟合度良好,方程的显著性及可靠性极高。各项方差分析表明,一次项A、B、D,交互项AB、BC、BD,平方项A2、B2、C2、D2对感官评分有极显著影响(p<0.01)。根据F值大小可知,各因素对乳酸含量影响的主次因素为D>A>B>C,即白砂糖加量>菌种比例>接种量>发酵时间。在交互项对感官评分的影响中,AB即菌种比例和接种量,BC即接种量和发酵时间及BD接种量和白砂糖加量交互作用对感官评分的影响有极显著影响(p<0.01),其响应面见图6。由于其他因素的交互作用对乳酸含量和感官评分的影响较小,所以未列出。

2.2.3 响应面图分析 由图5可以直观地看出各因素交互作用对乳酸含量的影响,若曲线越陡峭,表明响应值对于操作条件的改变越敏感,此因素的交互作用对感官评价的影响越大;反之曲面坡度越平缓,操作条件的改变对响应值的影响也就越小[32]。从图5可知,白砂糖加量和菌种比例的坡度很陡峭,说明两者交互作用对乳酸含量的影响很大,达到极显著水平(p<0.01);发酵时间和接种量交互形成的曲面很陡峭,说明发酵时间和接种量两因素的交互作用很强,对乳酸含量的影响达到极显著水平(p<0.01)。

从图6可知,接种量和菌种比例的坡度很陡峭,说明接种量和菌种比例两者交互作用变化明显,对感官评价的影响达到极显著水平(p<0.01);发酵时间和接种量交互形成的曲面很陡峭,说明发酵时间和接种量两因素的交互作用对感官评价的影响达到极显著水平(p<0.01);白砂糖加量和接种量的坡度很陡峭,说明两者交互作用对感官评价的影响很大,达到极显著水平(p<0.01)。

图6 菌种比例、接种量、发酵时间和白砂糖加量对感官评分影响的响应面

2.2.4 优化发酵工艺条件的确定及验证 利用Design-Expert 10.0.7 软件的optimization功能,得到复合乳酸菌发酵枸杞的优化工艺条件:菌种比例1∶1.2,接种量5.16%,发酵时间10.15 h,白砂糖加量5.06%;此发酵枸杞汁中乳酸含量达346 mg/100 mL,感官评分91.76 分。为了验证模型预测理论值的准确性和真实性,同时为了方便实际操作,将最佳发酵工艺的条件调整为菌种比例1∶1,接种量5%,发酵时间10 h,白砂糖5%,在此优化条件下进行3次平行试验,得到发酵液中乳酸含量平均值为(342±5.29) mg/100 mL,感官评分为(92.01±0.45)分,该实际值和预测值大小相近,其他理化指标的结果如表6所示。由表6可知,与发酵前相比较,发酵枸杞汁中的乳酸含量增加,蛋白质含量减少,总黄酮含量未改变,总糖含量降低。利用最优配方配制的复合乳酸菌发酵枸杞饮料为红色,酸甜适口,增强了枸杞的特殊风味。因此采用响应面法优化的复合乳酸菌发酵枸杞工艺条件准确合理,有实际指导意义。

表6 发酵结束后枸杞汁中各项理化指标的测定结果Table 6 Determination of physicochemical indexes in Lycium barbarum juice after fermentation

3 结论

本实验以枸杞为原料,选肠膜明串珠菌和植物乳杆菌对发酵工艺进行优化。最佳发酵条件为:菌种比例1∶1,接种量5%,发酵时间10 h,白砂糖5%。按照该配方制得的枸杞饮料为桔红色,色泽明亮,酸甜可口,具有枸杞特有的滋味和芳香。

该饮料的pH4.01,可溶性固形物8%,乳酸342 mg/100 mL,蛋白质20 μg/100 mL,总黄酮410 mg/100 mL,总糖124 mg/100 mL,乳酸菌菌落总数2.1×108CFU/mL,致病菌未检出。与发酵前相比较,发酵枸杞汁中的乳酸含量增加,蛋白质含量减少,总黄酮含量未改变,总糖含量降低。综上所述,本文利用肠膜明串珠菌和植物乳杆菌发酵枸杞汁,不仅产生大量的乳酸菌，还可以利用枸杞中的各种营养物质,产生多种风味物质和小分子氨基酸等营养物质。