绿豆多肽化橘红复合解酒饮料的制备及其体外解酒作用

葛驰宇,张君丽,*,董书池

(1.江苏食品药品职业技术学院制药工程学院,江苏淮安 223003;2.江苏省蛋白质类药物工程实验室,江苏淮安 223003;3.江苏今世缘酿酒学院,江苏淮安 223005)

中国是一个酒文化大国,从古至今,饮酒是各种社会交际活动不可或缺的一部分。大量饮酒给国人的健康带来了严重的伤害,尤其对肝脏的影响最大[1]。目前市场上的解酒产品品种繁多、但口味欠佳、功能性不一[2]。通过对解酒产品市场的调研,发现解酒产品以“解酒药”为主,主要有三个来源:第一类是海洋动物,开发成本较高,应用面有限。第二类是化学药物,同时含有兴奋剂、维生素等,解酒机理仅仅是促进酒精分解,起到暂时性的缓解作用,很难起到护肝作用,同时滥用会对身体有一定的毒副作用。第三类是中药,在各种中药解酒方剂中普遍使用葛根、甘草和陈皮,由于这些解酒中药材的使用已深入人心,对其解酒功效的挖掘也达极致[2-4]。因此,开发新的解酒中药材逐渐成为研究热点。

生物活性多肽具有绿色健康、易吸收、来源广、安全性好的特点[5],逐渐受到研究者的青睐,其中绿豆多肽可以激活乙醇脱氢酶(ADH)的活性,加速机体内乙醇的代谢,起到较好的解酒作用[6]。化橘红是芸香科植物油或化州柚未成熟或近成熟的干燥外层果皮,主要含有柚皮苷、野漆树苷、枳属苷及新橙皮苷[7],其中的柚皮苷对于急性酒精中毒有着一定的疗效,能较快地醒酒并缓解醉酒过程中产生的不适,对防止醉酒和加速醒酒具有良好的效果[8]。但是,目前缺乏将生物活性多肽与中药联合用于解酒领域的报道。

因此,本研究以绿豆多肽和化橘红为原材料,通过响应面实验获得感官品质较好的绿豆多肽化橘红复合解酒饮料(绿橘解酒饮,MECIB),并探讨绿橘解酒饮的体外解酒作用,以期为解酒产品的开发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆粕粉 淮安飞华农场;化橘红(经江苏益丰大药房麦艳研究员鉴定,其原植物为化州柚ExocarpiumcitriGrandis) 江苏益丰大药房;焦磷酸钠、乙醇、盐酸、邻苯三酚 南京化学试剂有限公司;木瓜蛋白酶、氧化型辅酶I、乙醇脱氢酶(ADH)、Tris-HCl、食品级柠檬酸、罗汉果甜 南京良玮生物科技有限公司;RU21解酒药(10 mg/mL,主要成分为维生素C、琥珀酸、富马酸、谷氨酸盐) 美国精神科学有限公司。

LST-20高速中药粉碎机 常熟市中药机械厂;Biosofre1000超声波破碎仪 赛飞(中国)有限公司;紫外-可见分光光度计、AR224CN电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;HH-S8数显恒温水浴锅 江苏金坛市金城国盛实验仪器厂;L-550台式离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;低速摇床 江苏天翎仪器有限公司;实验型饮料生产线 上海达程实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绿橘解酒饮的制备

1.2.1.1 绿豆多肽的制备 参照文献[9-10]方法提取绿豆多肽,主要流程如下:

水提取:料液比1∶15 g/mL(每克绿豆粕粉加入15 mL的去离子水),用去离子水维持pH在7.0,提取温度40 ℃,放入低速摇床,转速40 r/min,100 min后将离心机转速调至3000 r/min,离心18 min,除去不溶物后将上清液进行酸沉淀。

酸沉淀:上清液pH用1 mol/L盐酸调至4.5后放入低速摇床,设置转速为40 r/min,每隔5 min测定溶液pH,不停搅拌,并保持溶液pH始终在4.5左右,100 min后停止所有操作,静置30 min后将样品放入离心机,调整转速为3000 r/min,离心5 min,收集沉淀,去离子水洗两次,冷冻干燥,得绿豆蛋白。

酶解:将绿豆蛋白用木瓜蛋白酶水解,酶解条件为:酶解温度为55 ℃,酶解时间为4 h,料液比1∶15 g/mL,加酶量3000 U/g,酶解pH7.2。按此条件获得绿豆蛋白的水解产物。

超滤:选用截留分子量为2000和5000 Da的超滤膜,收集2000～5000 Da之间的绿豆多肽,再经活性炭处理、离子交换层析、真空浓缩、高压均质、喷雾干燥、过筛等程序,即得到绿豆多肽成品。

1.2.1.2 化橘红浓缩汁的制备 化橘红中解酒的主要成分是柚皮苷,依据文献[11-12],按下法制备化橘红浓缩汁:取化橘红隔水蒸煮,60 ℃烘干、粉碎,过40目筛,备用,即为化橘红样品。将该化橘红样品按下述条件进行提取:超声功率158 W,提取液乙醇浓度为40%,料液比1∶42 mL/g,提取温度为55 ℃,超声时间48 min。提取结束后收集提取液,抽滤,再减压蒸馏完全除去滤液中乙醇,浓缩至柚皮苷含量为1.6%(m/v)的化橘红浓缩汁。

1.2.1.3 绿橘解酒饮品的制备与口感改善 为了改善口感,采用罗汉果甜和柠檬酸改善饮品酸甜比。将绿豆多肽、化橘红浓缩汁、罗汉果甜和柠檬酸按一定的比例调配好,放入均质机,均质温度65 ℃,均质时间15 min,均质压力15 MPa。均质后迅速进入灭菌操作,即加热至85 ℃,恒温5 min,快速冷却至常温。灭菌后立即灌装到已灭菌好的洁净玻璃瓶中,封口备检,即为绿橘解酒饮成品。

1.2.2 感官品质评价 为尽量避免偶然误差和个体误差,本研究从不同的人群中随机选择人员17名对绿橘解酒饮进行感官评价实验,其中饮料生产专业人员9人,非饮料生产专业人员8人;男性12人,女性5人;20～30岁4人,31～40岁4人,41～50岁5人,51～60岁4人,通过上述17人的平均感官评分的高低来确定绿橘解酒饮的配比。绿橘解酒饮的感官品质评价标准参考文献[13-14],如表1所示。

表1 绿橘解酒饮感官品质评价标准Table 1 The beverage sensory evaluation standard of MECIB

1.2.3 绿橘解酒饮的单因素实验

1.2.3.1 绿豆多肽添加量对绿橘解酒饮感官品质的影响 固定化橘红浓缩汁添加量9%,罗汉果甜添加量0.1%,柠檬酸添加量0.18%,考察绿豆多肽添加量为12%、13%、14%、15%、16%时的感官得分,实验重复三次。

1.2.3.2 化橘红浓缩汁添加量对绿橘解酒饮感官品质的影响 固定绿豆多肽添加量为14%,罗汉果甜添加量为0.1%,柠檬酸添加量为0.18%,考察化橘红浓缩汁添加量为7%、8%、9%、10%、11%时的感官得分,实验重复三次。

1.2.3.3 罗汉果甜添加量对绿橘解酒饮感官品质的影响 固定绿豆多肽添加量为14%,化橘红浓缩汁添加量为9%,柠檬酸添加量为0.18%,考察罗汉果甜添加量为 0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%时的感官得分,实验重复三次。

1.2.3.4 柠檬酸添加量对绿橘解酒饮感官品质的影响 固定绿豆多肽添加量为14%,化橘红浓缩汁添加量为 9%,罗汉果甜添加量为0.1%,考察柠檬酸添加量为 0.14%、0.16%、0.18%、0.20%、0.22%时的感官得分,实验重复三次。

1.2.4 发酵工艺优化的响应面实验 通过对单因素实验结果分析,以绿豆多肽添加量、化橘红浓缩汁添加量、罗汉果甜添加量、柠檬酸添加量为自变量,以绿橘解酒饮的感官品质评分为考察指标,利用Design-Expert 8.0软件,设计4因素3水平的响应面实验,探索绿橘解酒饮的最佳感官品质配比,方案如表2所示。实验重复三次。

表2 绿橘解酒饮响应面实验设计因素水平Table 2 Experimental design factor and level of the response surface of MECIB

1.2.5 绿橘解酒饮体外乙醇脱氢酶(ADH)激活率测定 ADH的活力测定常采用瓦勒-霍赫法[15]。主要方法如下:在试管中加入1.5 mL的焦磷酸钠溶液(pH8.8),再加入1.0 mL的0.027 mol/L的氧化型辅酶I(NAD+),0.5 mL 11.5%的乙醇溶液,绿橘解酒饮0.1 mL,混匀后,置25 ℃水浴保温5 min,保温结束立即向试管中加入0.1 mL ADH(0.25 U/mL),混匀后立即在340 nm波长下用分光光度计测定吸光值A340,之后每隔10 s后记录一次A340,连续记录5 min。以0.5 mL蒸馏水代替11.5%的乙醇溶液做空白对照调零,以0.1 mL蒸馏水代替绿橘解酒饮为阴性对照,以公认解酒效果最好的等体积的进口药物RU21为阳性对照。取最初线性部分作图,以A340为纵坐标,时间为横坐标,计算每分钟A340的增加值(ΔA340)值,根据生成的NADH在340 nm时摩尔消光系数为6.2,计算ADH的活力单位,ADH的活力以每分钟生成NADH的纳摩尔数(nmol/min)表示,按公式(1)计算ADH活力,并按公式(2)计算激活率:

ADH活力(U/mL)=ΔA340/10s×(反应总体积/酶量)×106/(6.2×103)

式(1)

R(%)=(U1-U0)/U0×100

式(2)

式中：R为ADH激活率(%),U1为绿橘解酒饮样品的ADH活力,U0为阴性对照组的ADH活力。结果平行测定三次。

1.2.6 绿橘解酒饮的体外抗氧化效果测定 参照文献[16],体外测定超氧阴离子的方法为邻苯三酚法,即在10 mL比色管中加入4.5 mL的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L,pH8.2),1 mL的绿橘解酒饮,2.5 mL的蒸馏水混匀,10 min后加入0.1 mL的邻苯三酚(6 mmol/L),摇匀后静置3 min,加入0.1 mL的HCl(10 mmol/L)终止反应,在325 nm下测定溶液的吸光度,记为A1,以等体积的蒸馏水代替绿橘解酒饮作为空白组进行上述实验,吸光度记为A0,同样以等体积的RU21为阳性对照。清除率计算公式如公式(3)所示:

清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

式(3)

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 绿豆多肽添加量对绿橘解酒饮感官评分的影响 图1结果表明随着绿豆多肽的添加量增加,感官评分先增加后降低,当绿豆多肽添加量为14%时,绿橘解酒饮感官品质评价最高。这可能是提取绿豆多肽的过程中产生的豆腥味物质,其含量少时不影响感官评分,但随着绿豆多肽含量逐渐增加,豆腥味越来越浓,导致口感逐渐降低。所以绿豆多肽的添加量选择在13%～15%。

图1 绿豆多肽添加量对绿橘解酒饮感官评分的影响

2.1.2 化橘红浓缩汁添加量对绿橘解酒饮感官品质的影响 图2结果表明随着化橘红浓缩汁的添加量增加,感官评分也是先增加后降低,当化橘红浓缩汁添加量为9%时,绿橘解酒饮感官品质评价最高。这可能是化橘红随着含量增加,苦味越来越重,严重影响了饮料的口感,故化橘红浓缩汁的含量选择在8%～10%之间。

图2 化橘红浓缩汁添加量对绿橘解酒饮感官评分的影响

2.1.3 罗汉果甜添加量对绿橘解酒饮感官品质的影响 图3结果表明随着罗汉果甜的添加量增加,感官评分亦是先增加后降低,当罗汉果甜添加量为0.1%时,绿橘解酒饮感官品质评分最高。当罗汉果甜添加量超过0.1%时,可能绿橘解酒饮甜度过甜,破坏口感。因此罗汉果甜的添加量选择在0.05%～0.15%。

图3 罗汉果甜添加量对绿橘解酒饮感官品质的影响

2.1.4 柠檬酸添加量对绿橘解酒饮感官评分的影响 图4结果表明随着柠檬酸的添加量增加,感官评分亦是先增加后降低,当柠檬酸添加量为0.16%时,绿橘解酒饮感官品质评价最高。柠檬酸具有明显的酸味,微涩,可能是随着柠檬酸添加量的增加,当添加量超过0.16%时,绿橘解酒饮的酸味变强,影响口感。因此柠檬酸的添加量选择在0.14%～0.18%。

图4 柠檬酸添加量对绿橘解酒饮感官品质的影响

2.2 响应面试验结果

在单因素实验过程中,上述各成分添加量在很窄的范围内对绿橘解酒饮感官品质有较大的影响。根据单因素实验结果,以绿豆多肽添加量(A)、化橘红浓缩汁添加量(B)、罗汉果甜添加量(C)与柠檬酸添加量(D)为变量,使用Design-Expert 8.0软件,采用Box-Behnken法设计实验,方案及感官评分结果如表3所示。

表3 绿橘解酒饮感官品质评价响应面试验设计与结果Table 3 Response surface method design and results of the sensory evaluation on MECIB

2.3 绿橘解酒饮感官品质评价模型分析

应用Design expert 8.0对表3中数据进行分析,获得回归方程为R=78.96+3.63A+4.97B+1.56C-1.25D+5.32AB+3.37AC-1.95AD-3.98BC-3.87BD+3.93CD-1.63A2+1.68B2+7.02C2+3.64D2,方程的R2值为0.9748,方差分析表明,回归方程模型极显著(p<0.0001),且失拟项不显著(p=0.4032),表明该方程与实际的拟合度较好,可以使用该方程代替真实情况来寻找最佳绿橘解酒饮的配制条件。由表4方差分析模型的显著性可以发现,任意两个因素的交互关系(AB、AC、AD、BC、BD和CD)与各因素的二次项(A2、B2、C2和 D2)对绿橘解酒饮感官品质有显著影响(p<0.05),通过对回归方程系数绝对值大小的计算,可以判断对绿橘解酒饮感官品质的影响顺序为化橘红浓缩汁添加量(B)>绿豆多肽添加量(A)>罗汉果甜添加量(C)>柠檬酸添加量(D)。

表4 绿橘解酒饮的回归模型及方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation on MECIB

根据Design expert 8.0中“Optimization”功能,以最佳绿橘解酒饮感官品质(评分最高分)为目标,对绿橘解酒饮中各成分添加量进行筛选,结果显示最佳感官品质的理论评分为94.99分,配方为:为绿豆多肽添加量14.01%(0.01)、化橘红浓缩汁添加量为9.84%(0.84)、罗汉果甜添加量为0.05%(-1)、柠檬酸添加量为0.156%(-0.2)。按此配方进行验证试验,重复三次,最终获得感官评分均值为94.64±1.28,经回归方程拟合的理论评分与实际评分相差0.37%,表明用响应面法可以较好地设计绿橘解酒饮的制备工艺。

2.4 交互作用分析

为了便于观察上述绿豆多肽、化橘红浓缩汁、罗汉果甜、柠檬酸各自添加量这四个因素及其相互作用同时对绿橘解酒饮感官品质的影响,将其他两个因素保持不变,获得图5～图10所示的六组动态响应面的曲面图,图中R为感官评分。分析确定各因素的最佳参数的范围。

图5 绿豆多肽添加量(A)和化橘红浓缩汁添加量(B)的交互作用结果图

图6 绿豆多肽添加量(A)和罗汉果甜添加量(C)的交互作用结果图

图7 绿豆多肽添加量(A)和柠檬酸添加量(D)的交互作用结果图

图8 化橘红浓缩汁添加量(B)和罗汉果甜添加量(C)的交互作用结果图

图9 化橘红浓缩汁添加量(B)和柠檬酸添加量(D)的交互作用结果图

图10 罗汉果甜添加量(C)和柠檬酸添加量(D)的交互作用结果图

图5～图10的结果显示,各图中曲面均很陡峭,表明任意两个因素之间的交互作用对响应值的影响均很显著,与表4中方差分析结果完全吻合。其中图5所示为固定罗汉果甜添加量与柠檬酸添加量为零水平,绿豆多肽添加量与化橘红浓缩汁添加量对感官评分的影响和二者之间的交互作用。随着绿豆多肽的添加量逐渐增加,感官评分呈现平缓下降的趋势;而随着化橘红浓缩汁添加量逐渐增加,感官评分显著上升,且化橘红浓缩汁添加量导致感官评分的上升幅度明显比绿豆多肽添加量导致感官评分的下降的幅度要陡峭,说明化橘红浓缩汁添加量对感官评分的影响较绿豆多肽添加量大。

图8所示为固定绿豆多肽添加量与柠檬酸添加量为零水平,罗汉果甜添加量与化橘红浓缩汁添加量对感官评分的影响和二者之间的交互作用。随着罗汉果甜的添加量逐渐增加,感官评分呈现平缓下降成平台的趋势,而随着化橘红浓缩汁添加量逐渐增加,感官评分亦显著上升,且化橘红浓缩汁添加量导致感官评分的上升幅度大于罗汉果甜添加量导致感官评分的下降的幅度,说明化橘红浓缩汁添加量对感官评分的影响较绿豆多肽添加量大。

图9所示为固定绿豆多肽添加量与罗汉果甜添加量为零水平,柠檬酸添加量与化橘红浓缩汁添加量对感官评分的影响和二者之间的交互作用。随着柠檬酸的添加量逐渐增加,感官评分呈现下降趋势,而随着化橘红浓缩汁添加量逐渐增加,感官评分呈上升趋势,且化橘红浓缩汁添加量导致感官评分的上升幅度大于柠檬酸添加量导致感官评分的下降的幅度,说明化橘红浓缩汁添加量对感官评分的影响亦较柠檬酸添加量大。

2.5 绿橘解酒饮体外乙醇脱氢酶激活率测定结果

图11表明,绿橘解酒饮对ADH的激活率达到39.42%±0.77%,阳性对照RU21对ADH的激活率达到41.22%±1.66%,绿橘解酒饮与RU-21对ADH的激活率无显著性差异(p>0.05)。

图11 绿橘解酒饮和RU21的ADH激活率实验结果

2.6 绿橘解酒饮体外抗氧化结果

如图12所示,绿橘解酒饮对超氧阴离子的清除率达到90.16%±0.96%,阳性对照RU21对超氧阴离子的清除率达到92.78%±0.76%,绿橘解酒饮与RU-21对超氧阴离子的清无显著性差异(p>0.05)。

图12 绿橘解酒饮和RU21的抗氧化实验结果

3 结论

本文通过响应面法获得了绿橘解酒饮的最佳配比为绿豆多肽添加量14.01%、化橘红浓缩汁添加量为9.84%、罗汉果甜添加量为0.05%、柠檬酸添加量为0.156%。感官品质评分均分为94.64±1.28分,与模型预测结果(94.99分)相差0.37%,体外考察绿橘解酒饮对ADH的激活率为39%,对超氧阴离子的清除率达90%,与阳性对照RU21相比无显著性差异,显示出较好的体外解酒效果。综上所述,绿橘解酒饮制备工艺简单、口感佳、具有一定的解酒作用。