黑菊芋类黑精制备条件优化及组成成分分析

杨庆丽，姬妍茹，石杰，董艳，魏连会

(黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163319)

类黑精(Melanoidins)是美拉德反应中还原糖内的羰基与氨基酸、肽、蛋白质等中的游离氨基，经过缩合生成的一类棕褐色结构复杂的高分子聚合物[1]。类黑精在食品中广泛存在[2]，赋予食品特殊风味的同时还具有抗氧化、抗菌、降血压、降脂等功能[3-6]。类黑精的制备主要以水和乙醇为溶剂，郝日礼等的研究中随乙醇浓度增加，酒糟类黑精提取率降低，因此采用水为溶剂[7]；兰静等的研究中以体积分数80%的乙醇提取麦芽类黑精能够达到较高的提取率[8]。在类黑精组成方面，目前普遍认为类黑精是一类具有相似荷质比，结构非常接近的复杂混合物[9]。刘亚玲等[10]的研究表明，咖啡类黑精成分非常复杂，最多的为棕榈酸和硬脂酸，其次是胺类、酯类、酚类、吡咯类、呋喃类等。张会娟等[11]的研究表明，黄酒类黑精氨基酸组成中，含量最多的是脯氨酸、谷氨酸和甘氨酸。本研究对黑菊芋类黑精的制备条件进行了优化，同时采用Py-GC-MS和氨基酸分析仪对类黑精组成成分进行分析，为类黑精形成机理的研究提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菊芋：黑龙江省科学院大庆分院基地种植；乙醇、盐酸等试剂：均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Master-D UF实验室超纯水机 上海和泰仪器有限公司；Epoch酶标仪 美国BioTek公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；ISQ LT GC-MS联用仪 美国Thermo公司；台式高速冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司；HPX-9082数显电热培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 黑菊芋类黑精制备条件优化

黑菊芋类黑精制备条件优化采用分步正交法，将类黑精制备分为提取及醇沉两个部分。提取部分参考了王明慧等的试验方法[12]，分别以提取温度、料液比、提取时间、乙醇浓度作为考察对象。采用单因素、正交试验研究最佳提取参数。提取温度分别为25，30，35，40，45，50，55 ℃；料液比分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7；提取时间分别为1，2，3，4，5，6，7 h；乙醇浓度分别为0%(蒸馏水)、10%、20%、30%、40%、50%；以提取液在475 nm处的吸光值为指标测定提取率。醇沉参考了严昊的试验方法，以无水乙醇添加量及醇沉时间为考察对象，无水乙醇体积分别为提取液的1，1.5，2，2.5，3倍[13]；醇沉时间为2，3，4，5，6 h，以上清液吸光值为指标测定醇沉率。

1.3.2 黑菊芋类黑精Py-GC-MS分析

Py-GC-MS反应条件参考了刘亚玲等的方法。称取黑菊芋类黑精0.5 mg，包裹于铁磁体的热箔片中。

Py条件：热裂解温度450 ℃，时间10 s。

GC条件：J & W DB-5石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；分析采用一级程序升温，初始温度60 ℃，保持5 min，以30 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min；载气为氦气；流量为25 mL/min。

MS条件：电子电离源；传输线温度270 ℃；离子源温度220 ℃；扫描时间0.2 s；质量扫描范围50～400 m/z。以面积归一化法确定主要裂解产物的相对含量。

1.3.3 黑菊芋类黑精总氨基酸组成分析

本试验参考了董爱荣等[14]的分析方法；取类黑精100 mg，加入15 mL灭菌蒸馏水后充分溶解，加入15 mL浓HCl，氮吹仪30 min，105 ℃水解24 h。以14000 r/min离心10 min，取上清液3 mL于蒸发皿中，65 ℃水浴蒸干后以0.02 mol/L盐酸溶解定容至10 mL。0.22 μm水膜过滤后，氨基酸分析仪上样20 μL测总氨基酸组成。

1.4 数据处理

利用Excel 2007做图，采用Graphpad Prism 5进行差异显著性分析。P<0.05为显著性差异，P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 黑菊芋类黑精提取条件优化

2.1.1 单因素试验结果

图1 温度单因素试验 Fig.1 Single factor test of temperature

图2 料液比单因素试验Fig.2 Single factor test of solid-liquid ratio

图3 时间单因素试验Fig.3 Single factor test of time

图4 乙醇浓度单因素试验Fig.4 Single factor test of ethanol concentration

由图1～图4可知，随提取温度的升高，黑菊芋类黑精提取量显著增加(P<0.05)，35 ℃时达到最高，吸光度值为3.12，之后保持稳中有降趋势(P>0.05)。这可能是由于温度的升高促进了类黑精在溶剂中的扩散速度，但是当达到一定阈值时则不再升高，因此选择30，35，40 ℃ 3个水平进行下一步正交试验。料液比对黑菊芋类黑精提取的影响有一个先升后降的趋势，当料液比为1∶4时，提取率显著高于其他几组(P<0.05)，因此，后续试验中选用料液比1∶4作为中心试验点，选择1∶3、1∶4、1∶5 3个水平进行正交试验。随提取时间增加，类黑精提取率逐渐升高，4 h之后基本保持稳定状态，因此选择4，5，6 h 3个水平进行下一步试验。乙醇浓度与类黑精提取率呈负相关，因此，从低至高选择0%、10%、20% 3个浓度进行下一步正交试验。

2.1.2 正交试验结果

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal experiment design

由表1可知，提取温度、料液比、时间、乙醇体积分数均会影响类黑精的提取效果。因此，选取以上4个因素进行L9(34)正交试验。由结果可知，4个因素中，乙醇浓度>时间>温度>料液比，最佳条件为A3B3C3D1。由于最优方案不在试验方案中，因此做了验证试验。结果得出最优条件吸光度为3.2399，大于试验组。因此，黑菊芋类黑精最佳提取条件为40 ℃、1∶5、6 h、乙醇浓度0%(蒸馏水)。

2.2 黑菊芋类黑精醇沉条件优化

体积比单因素试验中，醇沉时间为4 h。由图5可知，无水乙醇与提取液体积比为2，2.5，3时上清液吸光值基本稳定(P>0.05)，因此选择这3个水平进行下一步试验。时间单因素试验中，体积比为2.5。由图6可知，随时间增加，上清液吸光度逐渐降低，4，5，6 h时无显著差异(P>0.05)，因此选择4，5 h 2个水平进行下一步试验。由于醇沉试验仅2个因素，因此将不同试验条件排列组合共6组试验，结果见表2。

图5 无水乙醇加量单因素试验Fig.5 Single factor test of absolute ethyl alcohol

图6 醇沉时间单因素试验Fig.6 Single factor test of ethanol precipitation time

序号无水乙醇∶提取液(V/V)时间(h)吸光度1240.23762250.224932.540.210842.550.21035340.19986350.1993

由表2可知，第6组试验吸光度值最小，为0.1993。显著低于1～4组(P<0.05)，与第5组无显著差异(P>0.05)。因此，黑菊芋类黑精醇沉条件为3倍无水乙醇加量反应6 h。

综合正交试验与醇沉试验，黑菊芋类黑精最佳制备条件为提取温度40 ℃、料液比1∶5、蒸馏水提取6 h，之后加入提取液3倍体积的无水乙醇醇沉6 h。

2.3 黑菊芋类黑精组成成分分析

2.3.1 热裂解气质分析

黑菊芋类黑精在450 ℃裂解温度条件下得到总离子流图见图7，裂解产物见表3。

图7 黑菊芋类黑精裂解总离子流图Fig.7 Pyrolysis total ion current chromatograms of melanoidins in black Jerusalem artichoke

序号时间(min)相似度(%)相对含量(%)中文名称英文名称12.1672.5918.182,5-二甲呋喃Furan, 2,5-dimethyl22.8851.914.312-丙二烯基环丁烯Cyclobutene, 2-propenylidene34.9051.903.902-丙烯基-3-环戊稀3-(2-Propenyl) Cyclopentene46.3453.443.472-糠醛2-Furancarboxaldehyde56.9558.830.303-甲基吡咯1H-Pyrrole,3-methyl67.0874.780.283-甲基吡咯1H-Pyrrole,3-methyl77.5079.011.031-甲基-2-羰基-2-环戊烯2-Cyclopenten-1-one,2-methyl88.7163.470.483-乙基呋喃1-H-Pyrrole,3-ethyl98.9993.970.865-甲基-2-糠醛2-Furancarboxaldehyde,5-methyl109.2170.820.583-甲基-1-羰基-2-环戊烯2-Cyclopenten-1-one,3-methyl119.9069.540.162-乙基-4-甲基吡咯1-H-Pyrrole,2-ethyl-4-methyl1210.5657.170.75苯酚Phenol1311.8387.110.432,3-二氢-3,5-二羟基-4-羰基-6-四基-4-氢吡喃4-H-Pyran-4-one,2,3-dihydro,5-dihydroxy-6methyl1412.8759.160.823-吡啶甲醇3-Pyridinol1513.4158.720.132-吡啶酰胺Picolinamide1613.8292.890.125-羟甲基糠醛5-Hydroxymethylfurfural1713.9764.570.225-羟甲基-2-氢-呋喃酮5-(Hydroxymethyl)dihydro-2-(3H)furanone1814.9268.340.63对苯二酚Hydroquinone1915.3063.860.252-甲基对苯二酚1,4-Benzenediol,2-methyl2017.8556.440.044-硝基苯胺Benzenamine, 4-nitro

黑菊芋类黑精裂解产物共75种，匹配度大于50%的为20种，分别为呋喃类6种，相对含量为23.33%，其中最高的为2，5-二甲呋喃，含量为18.18%，吡咯类3种，相对含量为0.74%，酚类3种，相对含量为0.63%；环烯类4种，相对含量为9.82%；胺类2种，相对含量为0.17%；吡喃类1种，相对含量为0.43%；吡啶类1种，相对含量为0.82%。王晓娜等[15]的研究中，发现云南小粒咖啡类黑精中主要挥发成分为糠醇、糠醛、呋喃、吡嗪、吡咯、酚类等。呋喃、噻吩、吡咯及其衍生物共同影响着热加工食品的风味，是美拉德反应的特征产物，在黑蒜类黑精中含量较高[16]。果糖热裂解可产生呋喃类、酸类、酮类、醛类和醇类等致香成分[17]。由此可见，这些成分是黑菊芋特殊风味形成的物质基础。

2.3.2 氨基酸组成分析

黑菊芋类黑精总氨基酸组成结果见表4；共检测出11种氨基酸，其中必需氨基酸3种。最高的几种氨基酸为精氨酸、丙氨酸、苏氨酸和天冬氨酸。秦礼康等[18]对豆豉类黑精氨基酸组成进行了分析，结果显示含量较高的是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸。研究表明，赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸是参与美拉德反应的主要氨基酸。因此，这几种氨基酸是美拉德反应模型建立的常用氨基酸[19，20]。吴慧伦等的研究表明赖氨酸能够与菊糖发生美拉德反应生成糠醛类物质[21]；因此，菊芋中的精氨酸、苏氨酸和天冬氨酸等可能直接参与了类黑精的形成，是黑菊芋呈色物质形成的物质基础。

表4 黑菊芋类黑精氨基酸组成Table 4 Amino acid composition of melanoidins in black Jerusalem artichoke

续 表

3 结论

本研究将类黑精制备分为提取和醇沉两部分。正交试验确定黑菊芋类黑精最佳提取条件为：提取温度40 ℃、料液比1∶5、蒸馏水提取6 h。醇沉条件为加入提取液3倍体积的无水乙醇作用6 h。组成成分热裂解气质分析中，含量较高的分别为呋喃类、吡咯类、酚类、环烯类、胺类和吡喃类。其中呋喃类最高，为23.33%。总氨基酸组成分析中，含量最高的几种氨基酸为精氨酸、丙氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，这些物质的共同参与为黑菊芋中呈香呈色物质的生成提供了基础。