不同腌制方法对山葵酸菜中亚硝酸盐含量的影响

王跃华，王宗兵，许芮菡，刘洪明，戴静，李亚林

(成都大学 生物工程学院，成都 610106)

腌菜是我国传统的蔬菜制品，分为非发酵蔬菜制品和发酵蔬菜制品。非发酵蔬菜制品腌制过程中用盐量较大，微生物发酵作用不明显。发酵蔬菜制品在腌制时用盐量较少，腌渍过程中有旺盛的乳酸发酵作用。这类产品一般都具有明显的酸味，主要包括泡菜和酸菜等[1，2]。

中国腌菜拥有广阔的国际市场，其中以四川的腌制蔬菜最为出名，但在国际市场上却不如韩国与日本。为满足人们不同的消费嗜好，增强我国酸菜在国际市场的竞争力，开展腌菜质量研究发展十分重要。然而腌菜中亚硝酸盐含量超标一直都是广受消费者关注的问题，我国食品卫生法规定了腌制品中亚硝酸盐含量应小于30 mg/kg[3，4]。

研究表明，蔬菜中亚硝酸盐的由来，主要是高等植物在生长过程中要利用土壤中的硝酸盐生成菌转化硝酸盐来合成自身生长必需的蛋白质，当气候干旱、光照不足、氮肥量大时，造成植物代谢混乱，而硝酸盐因无法有效利用而堆积于植物体内，在硝酸还原酶的作用下生成亚硝酸盐。当人体和食物中的亚硝酸盐和胺类或酰胺同时存在时，就会形成亚硝胺，亚硝胺是一级化学致癌物质，会诱发消化系统癌变。因此，阻断亚硝酸盐合成或消除亚硝胺的前体是防治癌病的有效途径之一。

本实验利用不同的传统腌制方法组合腌制酸菜，并采用盐酸萘乙二胺比色法[5-7]测定了山葵酸菜从腌制开始到成熟的过程中亚硝酸盐的变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料

制作酸菜原料：新鲜山葵叶(采自广元山葵种植基地)；老酸菜(连续发酵1年的山葵老酸菜)、酸菜水(连续发酵1年的山葵酸菜水)及普通泡菜水，均由广元市玺府生物科技有限公司提供；面水为10 g面粉溶于250 g水中煮开即可。

1.2 仪器与试剂

玻璃罐(500 mL)、HH-4S水浴锅、FA1204B/0.0001 g电子分析天平、UV-2201型紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；高速组织搅拌器、去离子水、各种试剂参照国标配制，各种药品均采用分析纯(A.R.)。

1.3 标准曲线的绘制

分别吸取不同量的亚硝酸钠标准溶液于比色管中构成不同亚硝酸盐浓度，加入4 g/L对氨基苯磺酸2 mL，摇匀静止3 min，加入1 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺，加水定容至刻度，静置15 min。于波长538 nm处测定吸光度，得标准曲线为y=0.61289x+0.01271, r=0.99926，线性范围为0～1.4 μg/mL。

1.4 样品的提取及净化

取适量已腌制的山葵酸菜于粉碎机中粉碎，称取5 g(精确至0.01 g)样品于50 mL烧杯中，加入12.5 mL的饱和硼砂溶液，再用300 mL的70 ℃水将其洗入500 mL容量瓶中，在沸水中水浴加热15 min后冷至室温。

冷却至室温后，加入5 mL亚铁氰化钾，摇匀，再加5 mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质。加去离子水至刻度，摇匀，倒入500 mL烧杯中，放置30 min后，上清液用滤纸过滤，弃去初液30 mL，滤液备用测量。

1.5 样品提取液的测量

取提取液40 mL于比色管中，加入4 g/L对氨基苯磺酸2 mL，摇匀，静置3 min。加入2 g/L盐酸萘乙二胺1 mL，加水定容至刻度，静置15 min。在波长538 nm处测定吸光度，带入标准曲线方程计算相应浓度及样品亚硝酸含量。

1.6 山葵酸菜腌制的配方

山葵酸菜腌制的配方见表1。

表1 山葵酸菜腌制配方Table 1 Curing formula of pickled Wasabia japonica g

注：配方中外加辅助发酵物质即代表相应腌制方法。

1.7 发酵母液乳酸菌的测定

参照国标给出的计数方法，在超洁净工作台中取老酸菜、酸菜水、泡菜水各10.00 g溶于100 mL无菌生理盐水中，同时搅拌20 s使老酸菜上菌体充分溶于无菌生理盐水中，取1 mL液体加入到9 mL无菌生理盐水中，适当稀释后各选择3个合适的梯度稀释液，分别取100 μL涂布于MRS固体培养基、YPD固体培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂固体培养基中，每个梯度做2次平行涂布。将MRS固体培养基置于37 ℃培养箱中培养48 h，YPD固体培养基置于30 ℃培养箱中培养3～5天，结晶紫中性红胆盐琼脂固体培养基置于37 ℃培养箱中培养24 h后计数。最后细菌计数选取平板菌数在30～300之间的平板进行数目分析计算，真菌计数选取平板菌数在10～100之间的平板进行数目分析计算。菌落计算公式：乳酸菌浓度=(菌落数×稀释倍数)/样品质量。

2 结果与分析

2.1 各外加辅助发酵物质乳酸菌含量

老酸菜：4.0 lg(CFU/g)、酸菜水：5.5 lg(CFU/g)、泡菜水：4.8 lg(CFU/g)。

2.2 各外加辅助发酵物质对酸菜亚硝酸盐含量的影响

2.2.1 酸菜水和面水对酸菜亚硝酸盐含量的影响

分析酸菜腌制过程中加了酸菜水时，再加面水对腌制过程中亚硝酸盐含量的影响。

图1 酸菜水和酸菜水+面水比较图Fig.1 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water and pickled Chinese cabbage water+flour water

由图1可知，在腌制酸菜过程中，无论是A1还是A2，其亚硝酸盐峰值均在10 mg/kg以下。在山葵酸菜的腌制过程中，加酸水其发酵作用强，使发酵过程中亚硝酸盐含量低，再加面水能显著延迟亚硝峰的出现。原因是A2中面水作为杂菌与乳酸菌生长的培养基，促使发酵前期杂菌与乳酸菌含量较A1组大，而A1由于无面水促进菌体生长，其乳酸菌利用其酸性环境缓慢生长，虽然前期杂菌产生的亚硝酸盐被积累，但杂菌数量与A2相比较少，第4天后乳酸菌数量增大到足够量，其能迅速降解前期积累的亚硝酸盐。而A2短时间内产生较大量杂菌与乳酸菌，乳酸菌利用其酸性环境与菌种优势的能力较A1小，杂菌产生较大量亚硝酸盐，同时乳酸菌也消除相应亚硝酸盐，亚硝酸盐的产生与消除平衡使亚硝酸盐一直处于较低但依然上升的状态，导致A2组较A1组亚硝峰推迟并降低。同时在腌制后期由于A2含有更多的杂菌，其后期乳酸菌菌种优势较A1小，亚硝酸盐消除较A1慢，因此后期亚硝酸盐量A2>A1。此外加面水实验组亚硝峰的峰值比不加面水低，原因可能是面水促进乳酸菌的生长，乳酸菌的快速繁殖产生乳酸及乳酸菌自身酶系统降解腌制过程中产生的亚硝酸盐[8]。

2.2.2 酸菜水、面水、老酸菜对酸菜亚硝酸盐含量的影响

图2 酸菜水、酸菜水+面水、老酸菜、老酸菜+面水配对比较图Fig.2 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water, pickled Chinese cabbage water+flour water,mature pickled Chinese cabbage,mature pickled Chinese cabbage water+flour water

分析酸菜腌制过程中加了老酸菜时，再加面水对腌制过程中亚硝酸盐含量的影响，同时比较酸菜腌制过程中加酸菜水与加老酸菜两种对应腌制方法对酸菜腌制过程中亚硝酸盐含量的影响。

由图2可知，比较A3与A4，在加了老酸菜的基础上再加面水的蔬菜腌制过程中亚硝峰出现比不加面水早，并且总的亚硝酸盐含量更低。其原因是A3、A4加入的老酸菜中乳酸菌含量较少，为4.0 lg(CFU/g)，而原料中杂菌较多，因此A3、A4乳酸菌菌种优势小[9]，面水更能促进杂菌的生长，其亚硝酸盐产量迅速上升，因此前2天A4亚硝酸盐含量较A3多。在高亚硝酸盐浓度下，乳酸菌降低亚硝酸盐作用更加明显，导致亚硝峰提前。比较A1与A3，A2与A4，在酸菜发酵的整个过程中，加酸菜水比加老酸菜的亚硝酸盐含量更低，亚硝峰出现明显延迟，并且加酸菜水实验组峰值仅为不加酸菜实验组的1/4。可以看出，在腌制蔬菜的过程中，加酸菜水比加老酸菜更能有效降低亚硝酸盐含量，原因是加的酸菜水中比加的老酸菜中含有更多的乳酸菌，A1、A2乳酸菌菌种优势较A3、A4大，能有效抑制杂菌的生长，从而抑制亚硝酸盐的产生[10]。另外，加酸水菜的蔬菜中pH更低，有利于乳酸菌生长进而抑制杂菌的生长。此外酸也能使产生的亚硝酸盐分解，从而使亚硝酸盐含量降低，同时使亚硝峰延迟。

2.2.3 3种外加辅助发酵物质的亚硝酸盐含量降低效果

分析比较3种外加辅助发酵物质(酸菜水、老酸菜、面水)对酸菜腌制过程中亚硝酸盐含量降低的能力。

图3 酸菜水、老酸菜、面水比较图Fig.3 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water, mature pickled Chinese cabbage,flour water

由图3可知，比较A3与A5得出，仅加老酸菜较仅加面水能快速降解腌制过程中产生的亚硝酸盐，并且使亚硝峰提前，整个腌制过程亚硝酸盐含量更少，原因是仅加面水乳酸菌含量较仅加老酸菜乳酸菌含量少，仅来源于原料自带乳酸菌，面水促进杂菌与乳酸菌生长过程中，前4天亚硝酸盐产生量大于消除量，亚硝峰推迟。并且由于A5后期杂菌较多，乳酸菌菌种优势不显著，所以后期亚硝酸盐降低较为缓慢。在研究腌制酸菜过程中降低亚硝酸盐含量的方法中，根据其整个腌制过程中亚硝酸盐含量降低效果对3种腌制过程中添加的外加辅助发酵材料排序，效果由好到差依次为：酸菜水>老酸菜>面水。

2.2.4 酸菜水、面水、老酸菜降低亚硝酸盐含量能力比较

分析确定酸菜腌制过程中，加入的酸菜水与老酸菜处于发酵降低亚硝酸盐主导地位，面水处于辅助地位。

图4 酸菜水+面水、老酸菜+面水、面水比较分析图Fig.4 Comparison and analysis chart of pickled Chinese cabbage water+flour water,mature pickled Chinese cabbage+flour water,flour water

由图4可知，3个实验组均加有面水，A5为仅加入面水实验组，其整个腌制过程亚硝酸盐前5天均处于超过国家标准水平的状态。A5基础上加入老酸菜后即A4组，整个腌制过程中亚硝酸盐相对于A5实验组降低明显，尤其是达到峰值后亚硝酸盐降解速度明显加快。若在A5基础上加入酸菜水即A2实验组，其整个腌制过程亚硝酸盐降低显著，其峰值仅为A5的1/4。由此比较说明，3个外加辅料中加入酸菜水与老酸菜处于发酵降低亚硝酸盐主导地位，面水处于辅助地位。

2.2.5 食盐和泡菜水对酸菜亚硝酸盐含量的影响

图5 食盐、食盐+泡菜水对比图Fig.5 Comparison chart of salt,salt+pickle water

由图5可知，所取泡菜水本身含有亚硝酸盐，但整个腌制过程中“泡菜水+食盐”对应腌制方法的酸菜亚硝酸盐含量更低，并且降解的速率也较快，原因是泡菜水比蔬菜自身含有更多的乳酸菌[11]，同时食盐形成的高渗透环境抑制杂菌生长，酸性环境既促进乳酸菌生长又促进亚硝酸盐降解，从而能有效降解蔬菜腌制过程中产生的亚硝酸盐。因此在腌制蔬菜时，加入适量的泡菜水与食盐能有效降解酸菜腌制过程中的亚硝酸盐，而且其整个腌制过程中亚硝酸盐含量均在8 mg/kg以下。另外，仅加食盐其亚硝酸盐含量也在12 mg/kg以下，与仅加面水相比能显著降低亚硝酸盐含量，其原因是高浓度的食盐对细菌有抑制作用，虽然乳酸菌同时被抑制，但杂菌产生的亚硝酸盐较少，同时乳酸菌逐渐形成的酸性环境有利于乳酸菌生长，因此酸菜中亚硝酸盐处于一个较低的水平。

2.2.6 7种酸菜腌制方法的亚硝酸盐含量降低效果

图6 7种腌制方法亚硝酸盐平均含量柱状图Fig.6 Column chart of average nitrite content in seven pickling methods

各实验组整个发酵过程亚硝酸盐平均含量可间接反应各实验组发酵过程亚硝酸盐总含量。由图6可知，A1组平均亚硝酸盐浓度最小，但A2与A1仅相差0.25 mg/kg，非常接近，且由前面分析可知A2亚硝峰更低，所以A1与A2所对应腌制方法的选择可根据实际应用需求确定。以各实验组亚硝酸盐平均浓度为标准为各实验组亚硝盐降低效果从大到小排序为：A1>A2>A6>A7>A4>A3>A5。

3 结论

酸菜水与面水同时加入是几种实验组中降低亚硝酸盐最显著的方法，并且其推迟亚硝峰的出现。食盐与泡菜水都能显著降解整个腌制过程中的亚硝酸盐，但在食盐基础上加入泡菜水能使整个腌制过程中的亚硝酸盐更低。

在腌制蔬菜的过程中，加入适量的酸菜水、老酸菜、泡菜水、食盐都能降低蔬菜腌制过程中产生的亚硝酸盐。7种组合腌制方法中降低亚硝酸盐效果以亚硝酸盐平均浓度为标准从大到小排序为：A1>A2>A6>A7>A4>A3>A5。以各实验组亚硝峰的峰值为标准从大到小排序为：A2>A7>A1>A6>A4>A3>A5。在本研究方案下，亚硝酸盐消除效果为：南方北方腌制方法结合>南方腌制方法>北方腌制方法。

无论哪种腌制方法，在腌制过程中都会产生亚硝酸盐，并且都会出现一个“亚硝峰”，这一“亚硝峰”是不可消除的[12]。以山葵为材料，加入酸菜水、泡菜水、食盐所对应的腌制方法其亚硝峰都低于食品监管标准30mg/kg，即整个腌制过程中都可食用。但是新鲜蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的含量与蔬菜的种属、生长期、栽培条件及蔬菜部位等因素有关。新鲜蔬菜的硝酸盐与亚硝酸盐含量大，则酸菜腌制过程中亚硝酸盐含量也大，反之亦然。但总体来说，若采用本实验中降低亚硝酸盐效果较好的几种方法会使整个腌制过程中亚硝酸盐含量低于30mg/kg，整个腌制过程都可以食用。

4 展望

接种乳酸菌发酵制作的泡菜风味由于其菌种单一，没有自然发酵风味好[13，14]，酸菜与泡菜发酵原理基本相同，所以其风味也是自然发酵更好。因此，本实验目的在于对生活中常用酸菜腌制方法进行研究与改进，完全采用日常生活中酸菜的腌制方法。为了便于生活运用，本实验以辅助发酵物质的添加量为标准，并未按照乳酸菌的量进行特殊辅助发酵物质的添加。在实际运用过程中可能会出现由于外加辅助发酵物质的乳酸菌含量不同，导致与本实验结果有所差别的现象，因此本实验给出了外加辅助发酵物质中乳酸菌含量以供实践者参考，同时也能启发相关食品工厂根据此参数进行定量研究生产。