基于分子对接和系统药理学小青龙汤治疗哮喘的作用机制

徐文华，郑景辉，杨文娜，董音汝，赵 阳，赵新望

1广西中医药大学研究生学院，南宁 530011；2广西中医药大学附属瑞康医院心内科，南宁 530000

哮喘是由多种细胞参与的气道慢性炎症性疾病。目前，全球至少有3亿哮喘患者[1]。中医认为哮喘是一种发作性的痰鸣气喘疾患[2]小青龙汤出自张仲景《伤寒论》，方中麻黄、桂枝、细辛解表；温散痰饮；半夏降逆化痰；甘草和中诸药相互配合，温肺化饮，化痰平喘，肺气复舒，宣降有权，诸症悉平[3]。临床应用小青龙汤治疗哮喘的疗效也比较显著，但是由于中药多成份、多靶点等原因，目前小青龙汤治疗哮喘的药效物质基础及分子生物学机制尚未完全被阐明。系统药理学具有“多成分、多途径、多靶点”协同作用的特点，从系统药理学角度对中药复方进行分析，其机理可能正是由于通过配伍药物之间相互协作、药物及其配体之间相互作用这一复杂关系网中的节点相互制约，从而使中药复方能有效打击疾病相关节点，保护整体网络平衡[4]。分子对接是一个预测蛋白质与配体的结合模式和结合自由能的强有力的计算工具,可以预测给定的蛋白质和配体(蛋白质、DNA/RNA、小分子)的结合模式及结合自由能,进而对其功能及作用机制进行研究[5]。本研究利用系统药理学和分子对接的方法，对小青龙汤的主要作用成分及作用靶点进行遴选，挖掘哮喘已知的相关靶点，根据网络拓扑分析及生物信息学分析小青龙汤治疗哮喘的潜在作用机制，为小青龙汤治疗哮喘的进一步探索提供参考。

1 材料与方法

1.1 小青龙汤的化学成分收集

本研究构建小青龙汤化学成分数据库采用的是TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/)，借助TCMSP数据库检索小青龙汤全方的所有化学成分，以建议药物筛选标准：口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%[6]。高口服生物利用度常常是决定生物活性分子作为治疗剂的类药性的关键指标。类药性(drug—likeness，DL)≥0.18[7]。筛选并得到小青龙汤中的活性成分。

1.2 小青龙汤化学成分靶点预测

将小青龙汤中8味药物中相应的化学成分分子结构以Mol2的格式上传PharmMapper数据库[8-10](http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php)，筛选剔除重复靶点。并将小青龙汤化合物潜在靶点信息录入UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中检索筛选物种为人源的靶点作为小青龙汤作用于哮喘的有效作用靶点。

1.3 小青龙汤化学成分靶点PPI网络的构建

为了说明靶点蛋白在系统上的作用，将1.2所得的小青龙汤潜在靶点信息上传STRING 10.5在线软件(http://string-db.org)，获得蛋白互作网络图。将从STRING数据库导出的结果导入Cytoscape 3.6.1(http://www.Cytoscape.org/)软件进行可视化分析，并进行拓扑学网络分析。进一步设置以Degree值大小体现颜色与节点大小，以边的颜色粗细反映Combined score大小，最终获得蛋白质相互作用网络。

1.4 小青龙汤化合物-靶点网络构建

每个节点(node)是基因、蛋白质或分子，而节点与节点之间的连接(edge)则代表着这些生物分子之间的相互作用[11]。选取小青龙汤每个有效化合物成分前10个靶点，将化合物及靶点信息导入Cytoscape 3.6.1软件进行可视化分析处理，计算其拓扑学参数并构建化合物-靶点网络。

1.5 哮喘相关靶点数据构建

本研究基于TTD及Genecards数据库综合筛选哮喘相关靶点，TTD数据库是一个提供关于耐药性突变的对目标和药物基因表达和目标组合的数据库[12]，经两大数据库挖掘共同筛选哮喘相关基因。利用Venn分析工具，将两者与小青龙汤潜在靶点进行比对分析。

1.6 生物信息学GO分析及信号通路富集分析

利用David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)上传小青龙汤对哮喘作用靶点的Gene Symbol格式，进行GO的生物学过程(Biological Process，BP)、细胞组成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)功能富集分析；同时利用David数据库利用KEGG信号通路分析,综合预测小青龙汤与哮喘关键靶点的生物学特性及调控通路。并且利用计算公式:

计算出富集因子，并绘制气泡图。

1.7 网络靶点特性拓扑学分析

运用Cytoscape 3.6.1软件中工具Network Analyzer计算网络的拓扑参数。本研究基于以下参数：平均最短路径(average shortest path length，ASPL)、介数中心性(betweenness centrality，BC)、中心接近度(closeness centrality，CC)、聚类系数(clustering coefficient，CC)、连通度(degree)评估节点在全网络中的重要程度。

1.8 主要活性成分-靶点分子对接

iGEMDOCK是通过基于对接位姿(蛋白质-配体相互作用)和化合物性质(即原子组成)使用k-均值和分层聚类方法提供后分析工具。iGEMDOCK一般用于活性筛选和快速对接。其结果以能量的高低去判断与化合物结合程度，一般化合物分子与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。在PDB(https://www.rcsb.org/)中搜索小青龙汤作用于哮喘的靶点名称并保存为pdb格式。配体以1.7中通过计算拓扑学参数得到的degree排名前五类的化合物以MOL2格式上传。

2 结果

2.1 有效成分筛选

共搜集了1 534个化合物，其中麻黄363个、桂枝220个、白芍85个、半夏116个、北五味子130个、细辛192个、干姜148个、甘草280个。根据OB和DL值筛选后最后得到麻黄23个、桂枝7个、白芍13个、半夏13个、北五味子8个、细辛8个、干姜5个、甘草92个化合物。化合物包括：甘草醇(glycyrol)、芍药苷酮(paeoniflorgenone)、异鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、紫杉醇(licopyranocoumarin)等，各个活性成分的OB和DL值见表1。

表1 小青龙汤化学成分表Table 1 Xiaoqinglongtang chemical composition table

续表1(Continued Tab.1)

化合物代码 Compound code相关化合物Related compound口服利用度 OB药物相似性DL药物DrugMOL002501[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate62.520.31EMOL004835Glypallichalcone61.60.19AMOL004907Glyzaglabrin61.070.35AMOL001736(-)-taxifolin60.510.27DMOL005000Gancaonin G60.440.39AMOL004824(2S)-6-(2,4-dihydroxyphenyl)-2-(2-hydroxypropan-2-yl)-4-methoxy-2,3-dihydrofuro[3,2-g]chromen-7-one60.250.63AMOL0048493-(2,4-dihydroxyphenyl)-8-(1,1-dimethylprop-2-enyl)-7-hydroxy-5-methoxy-couMarin59.620.43AMOL004328Naringenin59.290.21AMOL004328Naringenin59.290.21CMOL005003Licoagrocarpin58.810.58AMOL0048388-(6-hydroxy-2-benzofuranyl)-2,2-dimethyl-5-chromenol58.440.38AMOL010788Leucopelargonidin57.970.24CMOL004576Taxifolin57.840.27CMOL004576Taxifolin57.840.27DMOL005012Licoagroisoflavone57.280.49AMOL001558Sesamin56.550.83EMOL000211Mairin55.380.78AMOL000211Mairin55.380.78BMOL005018Xambioona54.850.87AMOL000492(+)-catechin54.830.24CMOL000492(+)-catechin54.830.24D

注：根据OB值降序排列，列出前50个化学成分。A：甘草；B：白芍；C：麻黄；：D：桂枝；E：细辛；F：干姜。

Note:Only the top 50 components are listed according to OB sort.A:licorice;B:white peony;C:ephedra;D:cassia twig;E:asarum;F:dried ginger.

2.2 小青龙汤化学成分潜在靶点预测及相互作用

PharmMapper数据库计算的潜在靶点是根据匹配度(fit score)由高到低进行排序。选取每个化学成分的前十个蛋白，共1 690个，进行下一步研究。将相同的靶点进行筛选剔除，结合Uniprot数据库确认及转换，最终共得到167个靶点，其中包括ETS1、GPI、DRAP1、XRN2、RAC1、UNC45A、CDCA8、SLC5A4、NR1D2、MDM2、MARS等。Network analysis发现,根据拓扑学参数计算网络中的网络度(degree)越大,说明小青龙汤通过该靶点治疗疾病的可能性越大，具体拓扑学参数见表2。其中介数中心性(betweenness centrality，BC)表达详见图1。靶点相互作用关系图详见图2其节点大小、颜色由拓扑学参数中网络度决定。

2.3 哮喘相关靶点数据构建及比对分析

在TTD、Genecards数据库中查询，发现经实验及临床试验的药物治疗性靶点有100个，与小青龙汤潜在靶点有3个重合；经Genecards数据库初步筛选出3 949个候选基因，根据“Relevance score”度取相关度最高的前300个结果，其中与小青龙汤靶点有11个重合。经合并数据库法查询共筛选出381个哮喘高度相关性靶点，与小青龙汤有13个重叠靶点，其韦恩图表达详见图3。

图1 小青龙汤化合物-靶点图拓扑学介数中心性Fig.1 Xiaoqinglong decoction compound-target map topology

表2 小青龙汤化学成分-作用靶点的拓扑学参数Table 2 Topological parameters of chemical constituents of Xiaoqinglong decoction

图2 小青龙汤的蛋白互作网络图Fig.2 Protein interaction network diagram of Xiaoqinglong decoction.

2.4 小青龙汤主要活性成分对哮喘作用靶点的生物信息学分析

利用David数据库进行GO分析的结果富集出43个生物学过程其中包括蛋白质磷酸化的正向调节(positive regulation of protein phosphorylation)、基因表达的正向调节(positive regulation of gene expression)、T细胞共刺激(T cell costimulation)等。

图3 小青龙汤作用靶点与哮喘靶点的韦恩图Fig.3 Venn diagram of Xiaoqinglong decoction using target and asthma target

蛋白质磷酸化是细胞生长和发育，信号转导和代谢等细胞内过程的重要构成因素。11个细胞组成其中包括细胞外泌体(extracellular exosome)、线粒体基质(mitochondrial matrix)、局灶性粘连(focaladhesion)等和9个分子功能其中包括蛋白激酶结合(protein kinase binding)、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、ATP结合(ATP binding)等。具体分类见图4。KEGG分析得到29条信号通路；其中包括PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、FXO信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路等，KEGG分析结果见表3。

2.5 分子对接结果

iGEMDOCK分子对接iGEMDOCK 分子对接结果将小青龙汤作用于哮喘的13个潜在靶点与小青龙汤中的经拓扑学参数计算主要的五类化合物beta-sitosterol、sitosterol、kaempferol、24-Ethylcholest-4-en-3-one[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] 、(1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate进行分子对接，配体与受体结合的构象稳定时能量越低发生的作用可能性越大，其结合力具体参数见图5；具体分子对接结果，见表4。其中结合性最强的是GSR与[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-7-carboxylate，其具体对接结果见图6。

图4 小青龙汤对哮喘作用靶点的GO分析的结果Fig.4 Results of GO analysis of Xiaoqinglong decoction on asthma target.

图5 小青龙汤主要化学成分和具体靶点对接结果Fig.5 Main chemical constituents and specific target docking results of Xiaoqinglong decoction

表3 小青龙汤对哮喘作用靶点的KEGG分析的结果Table 3 Results of KEGG analysis of Xiaoqinglong decoction on asthma target

续表3(Continued Tab.3)

信号通路Signal pathway基因名称Gene name-LgP甲状腺激素信号通路Thyroid hormone signaling pathwayPDPK1,CREBBP,TP53,MDM2,MTOR4.5胶质瘤GliomaTP53,MDM2,MTOR,EGF3.78HIF-1信号通路HIF-1 signaling pathwayEIF4E,CREBBP,MTOR,EGF3.26癌症中的胆碱代谢Choline metabolism in cancerPDPK1,RAC1,MTOR,EGF3.22鞘脂信号通路Sphingolipid signaling pathwayPDPK1,ROCK2,RAC1,TP533FoxO信号通路FoxO signaling pathwayPDPK1,CREBBP,MDM2,EGF2.86Wnt信号通路Wnt signaling pathwayROCK2,CREBBP,RAC1,TP532.82膀胱癌Bladder cancerTP53,MDM2,EGF2.66肌萎缩侧索硬化ALSAmyotrophic lateral sclerosis ALSRAC1,TP53,SOD12.49子宫内膜癌Endometrial cancerPDPK1,TP53,EGF2.46非小细胞肺癌Non-small cell lung cancerPDPK1,TP53,EGF2.39mtor信号通路mTOR signaling pathwayPDPK1,EIF4E,MTOR2.36病毒致癌Viral carcinogenesisCREBBP,RAC1,TP53,MDM22.33粘着斑Focal adhesionPDPK1,ROCK2,RAC1,EGF2.33肌动蛋白细胞骨架的调控Regulation of actin cytoskeletonROCK2,F2,RAC1,EGF2.3胰腺癌Pancreatic cancerRAC1,TP53,EGF2.27黑色素瘤MelanomaTP53,MDM2,EGF2.19癌症中的MicroRNAsMicroRNAs in cancerCREBBP,TP53,MDM2,MTOR1.94神经营养素信号通路Neurotrophin signaling pathwayPDPK1,RAC1,TP531.75细胞周期Cell cycleCREBBP,TP53,MDM21.73丙型肝炎Hepatitis CPDPK1,TP53,EGF1.67胰岛素信号通路Insulin signaling pathwayPDPK1,EIF4E,MTOR1.64爱泼斯坦巴尔病毒感染Epstein-Barr virus infectionCREBBP,TP53,MDM21.38亨廷顿氏病Huntington's diseaseCREBBP,TP53,SOD11.37cAMP信号通路cAMP signaling pathwayROCK2,CREBBP,RAC11.35

表4 小青龙汤主要活性成分-作用靶点分子对接结果Table 4 The main active ingredient of Xiaoqinglong decoction-the molecular docking result of the target

续表4(Continued Tab.4)

靶点名称Target namePDB ID化合物Compound分子对接得分Molecular dockingSOD11UXL[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-2-carboxylate-93.1844ROCK24L6Qβ-sitosterol-82.2422ROCK24L6QSitosterol-88.8998ROCK24L6QKaempferol-80.1915ROCK24L6Q24-Ethylcholest-4-en-13-one-82.3017ROCK24L6Q[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-11-carboxylate-87.5071RAC12H7Vβ-sitosterol-95.1734RAC12H7VSitosterol-94.6386RAC12H7VKaempferol-98.1151RAC12H7V24-Ethylcholest-4-en-6-one-95.9319RAC12H7V[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-4-carboxylate-104.737PDPK11W1Hβ-sitosterol-68.4275PDPK11W1HSitosterol-69.1211PDPK11W1HKaempferol-65.2296PDPK11W1H24-Ethylcholest-4-en-5-one-68.6266PDPK11W1H[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-3-carboxylate-71.7119MTOR4JSVβ-sitosterol-89.4241MTOR4JSVSitosterol-86.6296MTOR4JSVKaempferol-91.8557MTOR4JSV24-Ethylcholest-4-en-12-one-81.8009MTOR4JSV[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-10-carboxylate-88.0765MMP145OM3β-sitosterol-66.3335MMP145OM3Sitosterol-60.0399MMP145OM3Kaempferol-68.2973MMP145OM324-Ethylcholest-4-en-14-one-63.7437MMP145OM3[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-12-carboxylate-81.2716MDM24JRGβ-sitosterol-91.6804MDM24JRGSitosterol-91.2105MDM24JRGKaempferol-75.2285MDM24JRG24-Ethylcholest-4-en-11-one-88.2961MDM24JRG[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-9-carboxylate-80.641GSR3DJGβ-sitosterol-120.577GSR3DJGSitosterol-112.06GSR3DJGKaempferol-123.186GSR3DJG24-Ethylcholest-4-en-9-one-114.148GSR3DJG[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-7-carboxylate-124.458F22KXDβ-sitosterol-89.2748F22KXDSitosterol-99.0496F22KXDKaempferol-92.6111

续表4(Continued Tab.4)

靶点名称Target namePDB ID化合物Compound分子对接得分Molecular dockingF22KXD24-Ethylcholest-4-en-7-one-103.611F22KXD[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-5-carboxylate-83.7111EIF4E5BXVβ-sitosterol-102.627EIF4E5BXVSitosterol-101.004EIF4E5BXVKaempferol-112.228EIF4E5BXV24-Ethylcholest-4-en-15-one-103.53EIF4E5BXV[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-13-carboxylate-102.656EGF1NQLβ-sitosterol-85.4722EGF1NQLSitosterol-97.5038EGF1NQLKaempferol-86.5662EGF1NQL24-Ethylcholest-4-en-3-one-80.6163EGF1NQL[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate-83.7145CREBBP3DWYβ-sitosterol-96.6545CREBBP3DWYSitosterol-89.6597CREBBP3DWYKaempferol-86.0653CREBBP3DWY24-Ethylcholest-4-en-10-one-87.3514CREBBP3DWY[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-8-carboxylate-85.2097

图6 GSR与[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl- 4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl- 3-oxoprop-1-enyl]-2,2- dimethylcyclopropane-7-carboxylate分子对接结果 Fig.1 GSR and [(1S)-3-[(E)-but-2-eny1]- 2-methy1-4-oxo-1-cyclopent-2-eny1] [(1R,3R)-3-[(E)-3]-Methoxy-2-methy1- 3-oxoprop-1-eny1]-2,2-dimethylcyclopropane- 7-carboxylate docking results.

3 讨论

哮喘是世界上最常见的慢性疾病之一，是复杂的、多基因遗传倾向的疾病。哮喘的发病机制与炎症机制、神经调节等机制相关。目前主流治疗方式仍是以糖皮质激素、支气管舒张剂等西药治疗，它可作用于大多数炎症细胞和结构细胞。但是由于长期使用糖皮质激素可产生严重的副作用，虽然糖皮质激素有较好的疗效，但并不能从根本上解决疾病的发病和进展，因此积极寻找新的治疗药物和手段十分重要[13]。中医学对“咳嗽”“哮喘”有悠久而丰富的的治疗经验，能显著降低哮喘患者的发病次数提高患者生活质量，同时中医综合疗法的不良反应发生率低，具有极高的临床安全性[14]。小青龙汤方中麻黄含甘露糖、氨基葡萄糖、氨基甘露糖等具有重要的免疫抑制作用[15]，可凭借细辛的挥发油成分解除气管痉挛，进而有效治疗痰浊阻肺证、外寒内饮，并且针对痰湿水气凝于肾肺的症状也可明显改善，半夏具有抑制腺体分泌、镇咳的作用。但是中药方剂具有“多因、多效、多靶点”各个成分协同起效的作用，所以其具体分子机制难以被阐明。本研究基于分子对接模拟小分子配体与受体生物大分子相互作用、生物信息学分析结合系统药理学的角度对小青龙汤治疗哮喘的具体分子机制进行预测进而对小青龙汤治疗哮喘做出科学诠释。

在化合物筛选中，部分关键化合物分子具有高度的中心性。例如：异甘草素(isoliquiritigenin)、黄芩苷(Baicalin)、芍药苷(paeoniflorin)等，覃月穆[16]等在实验中发现，异甘草素通过抑制NF-κB信号通路的活化,抑制NF-κB p65入核使其不能发挥转录活性,最终影响其下游凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2，从而控制细胞凋亡。在小鼠哮喘动物实验研究中表明[17]，在小鼠哮喘模型中槲皮素能够调节Th1/Th2细胞平衡，可以抑制Gata-3表达增加T-bet表达，改变Th1/Th2极化，从而达到降低气道变应性炎症和气道高反应性的目的。在大鼠放射性肺损伤实验模型中，黄芩苷干预后明显降低了放射性肺损伤大鼠血清中TGF-β1、IL6 和TNF-α的含量，证明中药黄芩苷对促炎性因子具有一定的抑制作用，对放射性肺损伤具有一定的保护作用可以在一定程度上减轻肺损伤[18]。芍药苷可能是通过抑制氧化应激、激活PI3K/AKT和IκBα/NF-κB信号通路抑制MRL/1pr狼疮鼠的肺部炎症[19]。在化合物靶点网络中ETS1、GPI、DRAP1、XRN2、RAC1、UNC45A、CDCA8等靶点在网络拓扑学计算中占重要作用，这些靶点与血管生成参与伤口愈合来源、细胞运动、免疫反应来源、炎症反应等过程有关，并且存在着多重协同效应。

对小青龙汤的靶点网络分析后发现了多个与多种炎症反应、糖酵解、免疫调节紧密相关的关键靶点，如：SOD、GPI、RAC1等。因此我们对小青龙汤作用于哮喘的13个作用靶点进行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。在GO分析中发现小青龙汤可以对蛋白磷酸化的调节、血小板活化、细胞运动、肺发育等生物过程起调控作用。SOD1、MTOR、TP53等多个靶点在被富集出的重要生物学过程中协同起效。在KEGG分析的过程中PI3K/Akt信号转导通路、HIF-1信号转导通路、Wnt信号转导通路、mTOR信号转导通路、cAMP信号转导通路、MAPK信号转导通路等多条信号转导通路通过实验研究与哮喘的关系密切。其中在哮喘小鼠实验中，通过阻断 PI3K/Akt 信号转导通路，发现减少嗜酸粒细胞和中性粒细胞等炎性细胞在肺组织浸润，可以抑制杯状细胞增生引起的黏液高分泌，减少气道高反应，并阻止气道结构改变[20]。黄革等[22]，在实验中发现Epac作为一个新发现的cAMP下游信号分子，Epac抑制剂对气道黏膜杯状细胞增生、上皮下胶原沉积和气道平滑肌增生等重塑过程均具有明显促进作用，提示Epac对径可能对慢性哮喘气道重塑过程有一定保护作用。

临床应用小青龙汤汤治疗哮喘大大改善了患者的生活质量，减轻糖皮质激素使用引起的毒副反应，提高了疾病控制率。本研究基于系统药理学方法，初步探究了小青龙汤治疗哮喘的复杂机制过程，为后续从小青龙汤汤中提取有效药物成分治疗哮喘提供了科学理论基础，也对论证中药复方的科学性提供了参考。但是随着对中药复方认识的不断深入我们逐渐认识到由于中药成分复杂等多种原因，基于系统药理学和生物信息学对小青龙汤的认识仍存在很多不足，例如：小青龙汤可能通过药物中的小分子多肽、外泌体miRNA调节肠道菌群等对哮喘间接起到调控作用。因此对小青龙汤对哮喘的间接作用的研究以及基础实验的验证或将成为下一步研究的重要内容。