圈养丹顶鹤血变原虫的流行调查研究

贾 婷,郑常明,丁 楠,杨明海,赵素芬,林宝庆,张显光,罗 毅,张成林,索 勋

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;2.北京动物园圈养野生动物技术北京市重点实验室,北京 西城 100044;3.吉林向海国家级自然保护区管理局,吉林 通榆 137215;4.黑龙江扎龙国家级自然保护区管理局,黑龙江 齐齐哈尔 161002)

鸟类血孢子虫(Haemosporidia)包括疟原虫、血变原虫、住白细胞原虫,分布广泛,是感染鸟类的主要病原之一,威胁圈养和野生鸟类的健康[1-3]。小型野生鸟类,尤其是雀形目野生鸟类,因可以通过简单的网捕法捕获,所以其血孢子虫研究取样相对容易[1],对于大型鸟类,特别是受保护的物种,因采样困难导致其血孢子虫研究非常有限,在MalAvi数据库中可用的未鉴定物种的血孢子虫仅约100个记录[4]。在动物园和救护中心对鸟类的检查提供了关于大型受保护鸟类血孢子虫的有价值信息[5]。Scott发表了关于伦敦动物园鸟类中由血孢子虫引起严重疾病的第一个信息[6],在亚洲、欧洲、南美洲、北美洲和非洲的许多动物园都报道了严重的血孢子虫病[7-11]。研究表明,在动物园的鸟类中疟疾和其他血孢子虫存在潜在流行病学风险[10-13]。鹤(Gruiformes)被称为湿地生态系统健康评估的“标志物种”[14]。由于大多数的鹤科鸟类都是濒危和受保护物种[15],许多国家都建立了迁地保护项目,以保护这些鸟类的种群数量,并支持生物多样性保护。在圈养鹤中,血孢子虫感染的报道较少[16-18],然而这些血孢子虫可能是成功实施迁地保护项目的障碍[12]。

据统计,在中国鹤类中血孢子虫引起的疾病高达26.15%,尤其是幼鹤感染后影响较大,致死率较高,是造成圈养鹤大批死亡的主要疾病之一[17-18],目前,血变原虫引起鹤类发病的研究还未见报道。本研究分别采集北京动物园、扎龙国家级自然保护区和向海国家级自然保护区等地丹顶鹤、其他水禽、昆虫等动物的血液和虫体样品,采用基因测序方法,检测样品中血变原虫的感染情况,分析动物和传播媒介之间可能存在的关系,为建立珍稀鸟类疫病防控体系奠定基础。

1 材料

1.1 样品采集

1.1.1 采集地点 黑龙江扎龙国家级自然保护区、吉林向海国家级自然保护区、北京动物园(以下依次简称扎龙、向海、北京)。

1.1.2 样品种类及数量 丹顶鹤样品81份、水禽37种245份样品、昆虫3918只(见表1、表2、表3)。

1.1.3 采集时间 丹顶鹤血液、昆虫样品采集于2014年夏季;非丹顶鹤动物和北京动物园外鸟类样品为近几年积累采集。

1.2 样品保存

1.2.1 血液样品 新鲜血液分为3份,1份进行血涂片染色镜检,1份置于抗凝管-80℃保存,1份置于专用样品保存液,备用。

1.2.2 组织样品 对于病死鹤等动物,剖检后立即取肝、脾、肺、肾等脏器,分为2份,1份-80℃冻存,1份置于专用样品保存液中,备用。

1.2.3 昆虫样品 用捕蚊网等工具采伊蚊、库蚊、蚋、蠓,保存于专用样品保存液中,备用。

表1 丹顶鹤样品采集

表2 非丹顶鹤动物样品

表3 昆虫样品

2 方法

2.1 血涂片检测 取鹤类附跖静脉血5 μL,滴加于载玻片制备血涂片。甲醇固定,瑞氏姬姆萨染液染色30 min后,流水冲洗,风干后在光学显微镜下观察。先在400×镜头下找到目标位置,再用1 000×油镜目视检测,判断个体是否感染血孢子虫以及寄生虫的形态特征,判断其所属类群,每个血涂片观察100个视野[1]。

2.2 DNA提取和基因测序

2.2.1 基因组DNA提取 依照TIANGEN试剂盒的使用说明书进行血液及昆虫样品DNA提取。

2.2.2 基因组DNA电泳检测 取3 μL基因组DNA溶液,加入3 μL 2× Loading Buffer,充分混匀,1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测,凝胶用SYBR Green 1核酸凝胶染液染色,凝胶成像仪(GDS-8000PC,GENE,美国)中观察,主条带清晰者进行下一步研究。

2.2.3 蚊子COI基因片段扩增与测序 为准确鉴定所采集蚊子等昆虫的种类,选择物种鉴定通用的条码基因COI对昆虫样品进行PCR扩增[19]。所采用的引物为：C1J_1718(5′-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3′) 和 C1N_2191(5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′)。 蚊子 COI基因片段扩增体系：2×Tap酶混合溶液5 μL,引物C1J_1718、C1N_2191 各 0.2 μL,ddH2O 4 μL,模版 DNA 6 μL。蚊子COI基因片段扩增反应程序设置：Stage 1：95℃变性4 min;Stage 2：95℃变性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸45 s(20个循环);Stage 3：95℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸45 s(15个循环);Stage 4：72℃延伸7 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,凝胶用SYBR Green 1核酸凝胶染液染色,凝胶成像仪(GDS-8000PC,GENE,美国)中观察。电泳检测阳性者,配制40 μL反应体系进行PCR扩增,产物经电泳检测后送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

2.2.4 血液寄生虫cyt b基因片段扩增与测序 采用巢式PCR法,扩增鸟类血液寄生虫cyt b基因片段[20]。第一轮扩增引物为HeamNF1(5′-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3′) 和 HeamNR3(5′-ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3′)。 血 液 寄 生 虫cyt b基因片段扩增第一轮的10 μL体系体系包括：2×Tap酶混合溶液 5 μL,HeamNF1、HeamNR3 各0.2 μL,ddH2O 4 μL,模版 DNA 0.6 μL。 血液寄生虫cyt b基因片段扩增第一轮反应程序设置：Stage 1：94℃模版变性5 min;Stage 2：94℃产物变性30 s,50℃退火30 s,72℃引物延伸45 s(20个循环);Stage 3：72℃延伸10 min。第二轮扩增引物为HeamF(5′-ATGGTGTTTTAGATACTTACATT-3′) 和HeamR2(5′-CATTATCTGGATGAGATAATGGIGC-3′)。 反应体系同第一轮扩增,只是模板为第一轮扩增产物。血液寄生虫cyt b基因片段扩增第二轮反应程序设置：Stage 1：94℃模版变性5 min;Stage 2：94℃产物变性30 s,50℃退火30 s,72℃引物延伸45 s(35个循环);Stage 3：72℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测,凝胶用SYBR Green 1核酸凝胶染液染色,在凝胶成像仪(GDS-8000PC,GENE,美国)中观察结果。电泳检测为阳性的样品,以第一轮扩增产物为模版,配制40 μL反应体系进行第二轮PCR扩增,产物经电泳检测后送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。所有样品均重复检测3次。

2.3 测序结果分析方法 分别计算中间寄主和非鹤类鸟类血液寄生虫的感染率;用CodonCode Aligner(Copyright,美国)对cyt b基因的双向测序结果进行拼接,通过MalAvi数据库(Version 2.1.1)中的Blast模块进行序列比对,确定血液寄生虫所属类群[6]。DNA序列相似度达到100%的归为相同进化支。

2.4 血液寄生虫系统发育分析方法 选取Gen-Bank中血孢子虫目各科属已有序列和本研究测得的序列,共同构建系统发育树。根据 Outlaw和Ricklefs(2014)构建的血孢子虫目系统发育关系[21],选择小型哺乳动物的血液寄生虫肝囊虫(Hepatocystis.sp)作为系统发育树的外群。用DNASP v.5.10.1计算序列的单倍型数目(Haplotype number)等参数[22]。用jModelTest-v2.1.4进行碱基替代模型检验,根据贝叶斯信息标准(Bayesian Information Criterion,BIC)选择的单倍型树最适模型均为TN93+I+G。用BEAST v 1.8.0构建系统发育树[23]。采用严格分子钟,种群历史动态参数选择Yule模型,运行蒙特卡洛 -马尔科夫链(Monte Carlo Markov,MCMC)5×108代,每5 000代保存一次树。在Tracer v.1.5中检查运行结果,ESS值均大于200,表明MCMC链的运行达到稳定状态。利用TreeAnnotator v 1.7.5舍弃前2 000棵树(burnin=2 000)后,搜索最大分支置信树(Maximum Clade Credibility Tree,MCC Tree)。用FigTree v1.4.2打开所获得的MCC树,进行分析。

3 结果

3.1 丹顶鹤血变原虫的形态学特征 向海、扎龙自然保护区血涂片观察到多只丹顶鹤感染血变原虫,形态特征如下(见中插彩版图1)：血变原虫配子体寄生在宿主细胞质中,沿着受感染的红细胞细胞核生长,并且明显使宿主细胞核移位。未成熟配子体形态多不规则,日益增长的配子体通常不触及红细胞的核,因此,它会产生或多或少不太明显的未填充空间,如配子体与宿主红细胞核之间的一个“裂隙”(见中插彩版图1,A、B、D),这种“裂缝”在完全发育的配子体中消失(见中插彩版图1,C、E、F)。成熟配子体的外围边缘平滑,与红细胞的细胞膜紧密相靠,包裹红细胞细胞核生长,但不完全包裹,留有大约细胞核长度的空隙(见中插彩版图1,F)。大配子(见中插彩版图1,A、B、C)体原生质颗粒状,粗糙、蓝染,核红染,胞浆中有时会包含一些小液泡,色素颗粒随机分散在细胞质中,呈现圆形或椭圆形,平均直径大小为0.5～1.0 μm。 小配子体(中插彩版图 1,D、E、F)细胞质均匀,胞浆以及胞核染色均较大配子体染色浅。

3.2 丹顶鹤血变原虫的感染情况 在81份丹顶鹤样品中,血变原虫检出率为19.75%,共检测出两个血变原虫 Haemoproteus antigonis(hGRUJAP01)和Haemoproteus sp.(hGRUJAP02)进化支,其中hGRUJAP01检出15份,占检出样品的93.75%(15/16);hGRUJAP01与已知血变原虫序列GRUAME01相似性达100%,见表4。

3.3 非丹顶鹤鸟类(水鸟)血变原虫的感染情况在鸿雁等37种动物245份样品中,鹈鹕(Pelecanus rufescens)的样品中检出1个血变原虫hPELRUF01进化支,阳性率为0.41%,详见表4。

3.4 昆虫携带的血变原虫的情况 为了便于操作,把4种3 918只昆虫样品分成190份进行检测,其中2份检出血变原虫,阳性率为1.05%,在扎龙和向海的里海伊蚊(Ochlerotatus caspius)中都检出血变原虫(hOCHCAS01)进化支。蚊子中所检测出的血变原虫hOCHCAS01进化支与向海和扎龙丹顶鹤中所检测出的进化支hGRUJAP01和hGRUJAP02为近缘类群,见表4。

表4 丹顶鹤、水鸟、昆虫样品中血变原虫检查结果

3.5 感染血变原虫的系统进化关系分析 对丹顶鹤、鹈鹕、里海伊蚊中检出的血变原虫进行系统进化关系分析(图2)。本研究根据比对结果共定义了4个单倍型,形成了1个血变原虫属单系群。扎龙、向海的丹顶鹤单倍型hGRUJAP01,hGRUJAP02与北京动物园鹈鹕的血变原虫单倍型hPELRUF01以及扎龙、向海环境里海伊蚊中检测到的血变原虫单倍型hOCHCAS01与同一个血变原虫进化支(GRUAME01)近缘,而与其他已报道的鸟类血变原虫系统进化关系较远。

4 讨论

有关鹤科鸟类感染血孢子虫的研究报道较少,仅有两种血变原虫(H.antigonis和H.balearicae)和一种住白细胞原虫(L.grusi)感染鹤科鸟类的报道[1]。

血变原虫 H.antigonis最早的报道始于印度[21],目前尚未有我国丹顶鹤、鹈鹕和里海伊蚊中血变原虫的cyt b基因序列报道,本研究发现的鹤科鸟类感染H.antigonis在中国尚属首次报道。我们在丹顶鹤的血涂片中发现大量的血变原虫红内期配子体,与已报道的H.antigonis配子体形态相吻合[21]。本研究报道的血变原虫cyt b DNA序列(445 bp,GenBank登陆号MG980617)与在美国发现的鹤的血变原虫序列(616 bp,GenBank登陆号KX223873.1)[22]相吻合,因此我们推测本研究发现的血孢子虫属于H.antigonis。在幼鹤和成鹤中均发现有H.antigonis感染,表明在当地发生了血变原虫传播,幼鸟的血变原虫感染可能来源于亲鹤。

图2 感染血变原虫的系统进化关系分析

基于cytb基因序列的系统进化关系分析表明,在丹顶鹤、鹈鹕、里海伊蚊样品中发现的血变原虫的系统进化关系较近,并形成一个相对独立的单系群,这个单系群与其他已报道的鸟类血变原虫的系统进化关系较远。Darriba等(2012)报道血变原虫的传播媒介为虱蝇,本研究与其流行地域不同,我们推测系统进化关系较远的原因可能为H.antigonis可以通过与其他血变原虫传播媒介不同的双翅目昆虫媒介进行传播,但这一假设需要进一步的现场观察和实验研究来验证。

本研究发现在81份丹顶鹤样品中,血变原虫检出率为19.75%,虽然丹顶鹤等鸟类动物中血变原虫的感染率较高,但是感染血变原虫的发病率很低。所以我们不能确定目前检测出的血变原虫对丹顶鹤及相关动物潜在的致病作用。因此,我们要加强对珍稀鸟类中血变原虫以及其他血孢子虫的监测。

研究发现,在扎龙、向海的丹顶鹤,扎龙、向海的里海伊蚊,北京的鹈鹕样品中检测中相同的血变原虫进化支(GRUAME01),并且该进化支是感染率最高的进化支,并与向海丹顶鹤检出的血变原虫(BAFLA02)相似。伊蚊不是血变原虫传播的媒介,血变原虫能否在伊蚊体内完成生活史,伊蚊能否传播血变原虫,还有待进一步研究。但是在伊蚊中检测到血变原虫,也进一步证实环境中有血变原虫流行情况,我们推断是伊蚊叮咬了感染血变原虫的圈养鹤类或者其他鸟类而携带带有血变原虫的血液,进而被检测出。

综上,疫病监测是做好疫病防控的重要手段,特别是动物园、保护区的圈养动物与保护区濒危野生动物之间由于传播媒介的联系存在着密切的关系,因此要加强单位和部门之间的协同意识,建立疫病防控体系,对野生动物及生态保护有积极的意义。