Box-Behnken设计-响应面法优化芡实中总维生素E的提取工艺研究Δ

王红，吴启南，崔永伟，伍城颖，沈蓓，樊修和（.南京市溧水区中医院药剂科，南京00；.南京中医药大学药学院，南京 003）

芡实为睡莲科芡属一年水生草本植物芡（Euryale feroxSalisb.）的干燥成熟种仁，具有养血安神、益肾固精、补脾止泻、祛湿止带的功效[1-2]。在2007年，李美红等[3]从芡实中分离纯化了不同构型的生育酚（α、β、γ、δ-生育酚）类物质。生育酚又名维生素E，其中α-生育酚是自然界分布最为广泛、含量最多且活性最高的维生素E的存在形式[4]，作为细胞内的抗氧化剂[5]，其在促进性激素分泌、增强免疫功能、对抗自由基氧化等过程中扮演着重要的角色，同时也是芡实中医功效物质基础之一[6-7]。Box-Behnken设计-响应面法是一种优化工艺条件的有效方法，已被广泛地用于多因素的试验优化[8-11]。本文使用超声辅助法，以无水乙醇为提取剂，采用高效液相色谱法测定芡实中总维生素E的含量[12]，通过单因素试验考察提取时间、提取次数、超声功率、粉碎度对芡实中总维生素E提取量的影响，再利用Box-Behnken设计-响应面法优化其提取工艺条件，为后续芡实脂溶性成分的功效与物质基础研究提供试验依据，也为芡实中总维生素E的资源开发与利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，配有高精度四元梯度泵、三极管阵列检测器（PDA）、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；KH300SP超声波提取设备（昆山禾创超声仪器有限公司）；R-205旋转蒸发仪（瑞士步琪有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；BT125千分之一电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；SAGA-10TY实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）。

1.2 药品与试剂

芡实药材采自扬州高邮湖，经南京中医药大学吴启南教授鉴定为真品；α-生育酚（批号：120961，纯度：99%）、β-生育酚（批号：120894，纯度：99%）、δ-生育酚（批号：121052，纯度：99%）对照品均购自美国Sigma公司；抗坏血酸粉末（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20100108，试验中防止维生素E氧化）；甲醇为色谱纯，无水乙醇为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 芡实中总维生素E的提取

参考相关文献方法[10]，取干燥的芡实药材，打粉过80目筛；称取一定量的芡实粉末，置于锥形瓶中，依次加入无水乙醇、抗坏血酸溶液（质量浓度为0.05 g/mL），超声（频率：40 kHz，功率：240 W）提取，过滤，滤液转入球形蒸发瓶，于旋转蒸发仪上减压回收溶剂，得总维生素E干浸膏。

2.2 芡实中总维生素E的含量测定

总维生素E量以α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的总和计。

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Waters XBridge C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水溶液（97∶3，V/V）；检测波长为295 nm；柱温为30℃；流速为1 mL/min；进样量为10 μL。

2.2.2 溶液的制备 （1）混合对照品溶液的制备：分别精密称取12、5.6、0.96 mg的α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚对照品，至10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚质量浓度分别为1.2、0.56、0.096 mg/mL的混合对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：取“2.1”项下制备的干浸膏适量，用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 专属性考察 取“2.2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，α-生育酚与β-生育酚、β-生育酚与δ-生育酚的分离度均＞1.5，以α-生育酚峰计理论板数均＞2 000。色谱图见图1。

2.2.4 线性关系、检测限及定量限考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液0、100、200、500、800 μL至1 mL量瓶中，甲醇定容，取10 μL按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的线性回归方程及线性范围。另取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。当信噪比为3∶1时得检测限，当信噪比为10∶1时得定量限。α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的回归方程、线性范围、检测限及定量限见表1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

表1 α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的回归方程、线性范围、检测限及定量限Tab 1 Regression equation，linear range，detection limit and quantification limit of α-tocopherol，β-tocopherol and δ-tocopherol

2.2.5 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验 将α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚对照品按相关方法进行操作。结果，在精密度试验中，α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面积的RSD分别为1.53%、1.88%、2.06%（n＝6），表明该方法精密度良好；在重复性试验中，α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面积的RSD分别为2.05%、1.64%、2.18%（n＝6），表明该方法的重复性良好；在稳定性试验中，24 h内α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面积的RSD分别为1.36%、2.42%、1.73%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定；加样回收率试验中，α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的平均加样回收率分别为98.23%、101.75%、104.32%，RSD分别为1.62%、2.41%、1.55%（n＝9）。

2.3 单因素试验筛选芡实中总维生素E提取工艺

在对芡实中总维生素E的提取过程中，药材的提取时间、提取次数、超声功率、粉碎度等因素对提取率有着重要的影响[13-17]。因此在本试验中，选择上述因素进行考察。

2.3.1 提取时间 称取60目芡实粉末6份，每份2 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，依次加入60 mL无水乙醇，10 mL抗坏血酸，在超声功率为240 W的条件下提取1次，考察不同提取时间（10、20、30、60、120、180 min）对芡实中总维生素E提取量的影响。结果，随着提取时间的增加，芡实中总维生素E提取量先呈上升趋势，当提取时间为60 min时，总维生素E提取量最高（1.644 mg/g），再增加提取时间总维生素E提取量呈下降趋势，由此确定芡实中总维生素E超声提取时间为60 min，详见图2A。

图2 各因素对芡实中总维生素E提取量的影响Fig 2 Effects of each factor on the extraction amount of total vitamin E in E.ferox

2.3.2 提取次数 称取60目芡实粉末6份，每份2 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，依次加入60 mL无水乙醇，10 mL抗坏血酸，提取时间为60 min，超声功率为240 W的条件下分别提取1、2、3、4、5、6次，考察不同提取次数对芡实中总维生素E提取量的影响。结果，随着超声提取次数的增加，芡实中总维生素E提取量先呈上升趋势，当提取次数为3次时，总维生素E提取量最高（1.754 mg/g），再增加提取次数总维生素E提取量呈下降趋势，由此确定芡实中总维生素E超声提取次数为3次，详见图2B。

2.3.3 超声功率 称取60目芡实粉末6份，每份2 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，依次加入60 mL无水乙醇，10 mL抗坏血酸，提取时间为60 min，分别以超声功率150、180、210、240、270、300 W提取1次，考察不同超声功率对芡实中总维生素E提取量的影响。结果，随着超声功率的增加，芡实中总维生素E提取量先呈上升趋势，当超声功率达到240 W时，总维生素E提取量最高（1.786 mg/g），再提高超声功率总维生素E提取量呈下降趋势，由此确定芡实中总维生素E超声的功率为240 W，详见图2C。

2.3.4 粉碎度 称取芡实过筛20、40、60、80、100、120目粉末各1份，每份2 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，依次加入60 mL无水乙醇，10 mL抗坏血酸，超声功率为240 W，提取时间为60 min，考察不同粉碎度对对芡实中总维生素E提取量影响。结果，随着粉碎度的增加，芡实中总维生素E提取量呈上升趋势，当粉碎度达到80目，总维生素E提取量最高（1.742 mg/g），再提高粉碎度，总维生素E提取量呈下降趋势，由此确定芡实中总维生素E的粉碎度为80目，详见图2D。

2.4 Box-Behnken设计-响应面法优化芡实中总维生素E的提取工艺

2.4.1 试验设计 以提取时间（X1）、提取次数（X2）、超声功率（X3）、粉碎度（X4）为自变量（Xi），总维生素E提取量（Y）作为响应值，采用中心试验设计方案，在4因素3水平的基础上，运用响应面法优化芡实总维生素E的最佳提取工艺，因素与水平见表2，试验设计与结果见表3。

表2 因素与水平Tab 2 Factors and levels

表3 试验设计与结果Tab 3 Design and results of tests

2.4.2 模型建立与方差分析 采用Design-Expert V 8.0.6软件进行结果统计并分析处理相关数据，得到二次多项回归方程Y＝2.04+0.12X1+0.34X2+0.10X3+0.088X4+0.073X1X2－0.099X1X3－0.023X1X4－0.13X2X3－0.049X2X4－0.091X3X4－0.49X12－0.30X22－0.40X32－0.49X42（R2＝0.952 5）。方差分析结果见表4。

由表4可知，该模型的P＜0.000 1，表明虚拟模型显著，具有统计学意义；提取次数、提取时间、超声功率对芡实总维生素E提取量的影响显著，各因素的二次项系数也均对芡实中总维生素E提取量的影响显著；交互项X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4对芡实中总维生素E含量的影响不显著，各因素对芡实中总维生素E提取量影响的大小顺序依次为X2＞X1＞X3＞X4。

表4 方差分析结果Tab 4 Results of variance analysis

2.4.3 响应面分析 利用Design-Expert V 8.0.6软件分析，得出影响芡实中总维生素E提取量的各因素交互作用的相应响应面图，各因素对芡实中总维生素E提取量的影响见图3。

由图3可知，提取时间与超声功率之间、提取时间与粉碎度之间、超声功率与粉碎度之间的交互作用增强，但还未达到显著水平，而提取次数与提取时间之间、提取次数与超声功率之间、提取次数与粉碎度之间的交互作用不显著，总维生素E的提取量随着提取时间、超声功率、粉碎度三者之间的交互作用呈现由低到高再到低的趋势。因此，在适合的提取时间、超声功率、粉碎度下，总维生素E的提取量会出现极大值，且应位于响应面的顶部。由Design-Expert V 8.0.6软件分析得出：在稳定状态下芡实中总维生素E提取量的最大值为2.153 mg/g，相对应的提取时间为80.49 min、提取次数为3.54次、超声功率为242.69 W、粉碎度为80.44目。以实际操作的方便考虑，将其修正为提取时间80 min、提取次数3次、超声功率240 W、粉碎度80目。

2.4.4 验证试验 根据优化提取工艺，分别取芡实药材2、20、40 g进行3次平行试验，结果，总维生素E的提取量分别为2.063、2.103、2.085 mg/g（RSD分别为2.6%、1.5%、1.3%，n＝3），与预测值2.092 mg/g的相对误差分别为0.14%、0.53%、0.33%，提示3次验证试验的总维生素E提取量差异较小，说明该工艺稳定可靠。

图3 各因素与芡实中总维生素E提取量之间的响应面图Fig 3 Response surface plots for each factors on the extraction amount of total vitamin E in E.ferox

3 讨论

中药芡实的化学成分多样，但由于其含有大量淀粉，加大了分离芡实药效成分的难度。为了优化芡实总维生素E的提取工艺，笔者通过预试验，先后考察了提取方法、提取溶剂的种类、提取次数、提取时间、超声功率、粉碎度等对芡实中总维生素E提取量的影响。在提取方法方面，笔者比较了回流法、超声法与索氏提取法，结果超声法提取效果最好，操作简单；随后，又考察了以石油醚、无水乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、甲醛等为溶剂对提取量的影响，结果以无水乙醇为溶剂提取效果最好。综合考虑，提取时间、提取次数、超声功率、粉碎度对芡实中总维生素E提取量的影响较大，故选择这4个因素对其提取工艺进行优化。

本研究结果显示，随着提取时间的延长，总维生素E的提取量先上升后下降，推测其原因可以与其易氧化有关，导致维生素E的化学结构被破坏，提取量降低；随着超声功率变大，总维生素E的提取量不断增加，但过强的超声功率会破坏芡实中维生素E的结构，故维生素E的提取率随超声功率的增强呈先上升后下降的趋势；粒度过粗的芡实粉末由于与溶剂的接触面积小，提取效率低，粒度过细的芡实粉末使得分子与分子间的吸附作用增强，故随着芡实粉碎度的增加，维生素E的提取量也是呈先上升后下降的趋势。

综上所述，本文通过Box-Behnken设计-响应面法成功优化了芡实中总维生素E的提取工艺，且优化后的提取工艺合理可行，可为芡实中总维生素E的开发与利用提供参考。