聚焦超声治疗对外阴低级别鳞状上皮内病变模型大鼠外阴皮肤缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子及突变型p53表达的影响

范艺巾，唐华均，刘 瑶，李成志

(重庆医科大学生物医学工程学院 省部共建国家重点实验室培育基地—重庆市超声医学工程重点实验室 重庆市生物医学工程学重点实验室 重庆市微无创医学协同创新中心，重庆 400016)

外阴鳞状上皮内病变是局限于外阴鳞状上皮内且有进展为浸润癌潜在风险的癌前病变，也称为外阴鳞状上皮内瘤变(vulvar squamous intraepithelial neoplasia， VIN)、外阴鲍恩病和原位癌，临床多表现为外阴瘙痒、皮肤破损及溃疡等[1]，2014年WHO女性生殖器肿瘤分类[2]将其分为低级别鳞状上皮内病变(low grade squamous intraepithelial lesion， LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion， HSIL)和分化型外阴上皮内瘤变。近年外阴鳞状上皮内病变发病率逐年升高，且患者更趋于年轻化[1,3]。药物治疗、物理治疗及外科手术是目前临床治疗外阴鳞状上皮内病变的主要方式，但治疗后复发率仍为25%～50%，且患者对手术治疗的依从性较差[4]。聚焦超声治疗具有治疗时间短、术后恢复快、安全性高等优点[5-6]，可安全、无创、有效地治疗129/J型外阴上皮内瘤变模型小鼠[7-8]。 Jia等[9]采用聚焦超声治疗HSIL后6个月，89%患者症状缓解，组织病理学表现基本恢复正常，无进展为外阴浸润癌者。本研究建立大鼠外阴LSIL模型，探讨聚焦超声治疗对模型大鼠外阴皮肤中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)及突变型p53(mutant type p53， mtp53)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立 选取6～8周龄SPF级雌性SD大鼠28只[由重庆医科大学动物实验中心提供，许可证号:SYXK(渝)2017-0023]，体质量160～180 g，平均(170.30±7.16)g。参考本课题组前期研究[10]方法，通过机械刺激联合0.5%二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenzanthracene, DMBA)丙酮溶液涂抹，于每周固定时间进行实验处理，共14周，建立SD大鼠外阴LSIL模型。将28只模型大鼠随机分为治疗组和对照组，每组各14只。

1.2 聚焦超声治疗 对治疗组大鼠以0.6%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后保定于操作台，常规备皮、涂抹超声耦合剂。采用海极星CZF型超声波妇科治疗仪，以5～10 mm/s恒定速度连续直线辐照，辐照区域包括外阴病变区及其周围组织5 mm范围内区域，频率10.20 MHz,功率2.5 W，焦距3.5 mm。辐照过程中采用泰仕TES-1310测温仪监测表皮温度，达40℃时则停止辐照[7]。对照组大鼠给予超声假辐照，治疗仪无功率输出。

1.3 组织病理学观察 分别于模型建立后及聚焦超声治疗后4周，以直径3 mm的皮肤钻环取大鼠外阴皮肤，置于4%多聚甲醛中固定，经再脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后，采用Olympus BX40型光学显微镜观察组织病理学变化。

1.4 免疫组织化学检测 聚焦超声治疗后4周，另取大鼠外阴皮肤，制备石蜡块切片，脱蜡及脱水后，行抗原修复。在室温避光条件下，于3%双氧水溶液中孵育25 min，滴加3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)200 μl，室温封闭30 min；加入用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline， PBS)配制好的一抗，HIF-1α、VEGF、mtp53抗体工作浓度分别为1∶400、1∶1 000、1∶100，以PBS漂洗后，再滴加50 μl与一抗相应种属的二抗，最后滴加100 μl二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色液进行显色，并脱水封片，分别用于HIF-1α、VEGF及mtp53检测。采用Olympus BX40型光学显微镜进行观察并采集图像，通过IPP 6.0软件进行光密度分析；在高倍(×400)镜下从每张切片中随机选取5个高倍视野，计算平均光密度值，代表蛋白的相对表达强度。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。计量资料以±s表示，采用独立样本t检验比较2组间HIF-1α、VEGF及mtp53表达的差异；计数资料以百分率表示，采用χ2检验比较2组大鼠外阴组织病理结果的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验处理14周后，2组模型大鼠外阴皮肤组织病理学检查均出现LSIL病理改变，证实模型建立成功，见图1。

2.1 聚焦超声治疗后大鼠外阴组织病理学变化 超声辐照/假辐照后4周，治疗组13只(13/14，92.86%)大鼠外阴皮肤基本恢复正常结构(图2A)，1只(1/14，7.14%)仍表现为LSIL；对照组4只(4/14，28.57%)大鼠仍表现为LSIL，10只(10/14，71.43%)进展为HSIL(图2B)。2组间外阴皮肤组织病理结果差异有统计学意义(χ2=24.80，P<0.001)。

2.2 聚焦超声治疗后大鼠外阴皮肤中HIF-1α、VEGF及mtp53表达 HIF-1α和VEGF的表达位于细胞质和细胞膜，mtp53的表达位于细胞核，治疗组染色较浅而对照组颜色较深，见图3。超声辐照/假辐照后4周，治疗组大鼠外阴皮肤中HIF-1α、VEGF及mtp53表达与对照组相比均明显减低(P均<0.001)，见表1。

表1 免疫组织化学检测2组外阴LSIL模型大鼠外阴皮肤中HIF-1α、VEGF及mtp53表达(平均光密度值，×10-2，±s，n=14)

表1 免疫组织化学检测2组外阴LSIL模型大鼠外阴皮肤中HIF-1α、VEGF及mtp53表达(平均光密度值，×10-2，±s，n=14)

组别HIF-1αVEGFmtp53治疗组0.04±0.011.29±0.080.03±0.02对照组1.12±0.233.15±0.690.93±0.15t值11.236.5513.66P值<0.001<0.001<0.001

3 讨论

聚焦超声治疗是一种新兴的非侵入性局部治疗技术，现已广泛用于治疗多种肿瘤及非肿瘤性疾病[11-14]。其原理是体外发射低能量超声波，使之透过表层组织聚焦于特定靶区，在通过热效应、机械效应和空化效应等导致病变组织变性、坏死的同时，保持局部解剖结构的完整性[11]。Wu等[15]报道，聚焦超声治疗外阴上皮内非瘤样病变的总有效率达93.38%，且无严重并发症发生。Jia等[8]采用聚焦超声治疗129/J型VIN模型小鼠，治疗后2个月总有效率为100%(35/35)。本研究建立外阴鳞状上皮内病变大鼠模型，发现聚焦超声治疗后4周92.86%(13/14)的治疗组模型大鼠外阴皮肤基本恢复正常组织结构；而对照组大鼠中，28.57%(4/14)仍表现为LSIL，71.43%(10/14)进展为HSIL；表明聚焦超声治疗外阴LSIL安全、有效，聚焦超声有助于阻止甚至逆转LSIL向HSIL发展。

低氧是实体肿瘤及炎症性疾病组织微环境中的病理生理特征之一。HIF-1α是在低氧条件下调控氧平衡的主要转录因子，在人及哺乳动物细胞内广泛存在。在正常生理状态下，细胞中HIF-1α蛋白极少；但当细胞处于持续缺氧状态时，降解HIF-1α的泛素化途径被阻断，蛋白表达量明显增加且蛋白稳定性增强；且HIF-1α可直接激活VEGF、促红细胞生成素和胰岛素样生长因子等下游靶基因的转录和表达，从而调控血管新生、细胞增殖及生存、能量代谢、肿瘤侵袭及转移等，这一系列生物学效应对细胞自身调节、肿瘤微血管形成及癌前病变的发生具有重要意义[16]。HIF-1α在膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、食管癌、口咽癌和皮肤癌等多种肿瘤均呈高表达，某些癌前病变也存在HIF-1α高表达[17]。杜善平等[18]研究发现，正常外阴组织中HIF-1α蛋白几乎无表达，而在VIN中HIF-1α表达升高。本研究结果显示，治疗组大鼠外阴皮肤中HIF-1α表达较对照组明显降低，提示聚焦超声治疗可通过下调HIF-1α表达而改善局部组织氧平衡状态。

图1 外阴LSIL模型大鼠外阴皮肤组织病理图 鳞状上皮增厚，上皮下半部细胞密度增加，极性轻度紊乱、大小不等，轻度异形性，可见核分裂象(HE，×100) 图2 超声辐照/假辐照后外阴LSIL模型大鼠外阴皮肤组织病理学变化(HE，×100) A.治疗组大鼠超声辐照后4周外阴皮肤基本恢复正常； B.对照组大鼠超声假辐照后4周进展为HSIL，可见异常角化珠(箭)

图3 超声辐照后4周外阴LSIL模型大鼠外阴皮肤中HIF-1α、VEGF及mtp53表达情况(×400) A、B.对照组大鼠HIF-1α染色较深(A，黑箭)，治疗组大鼠HIF-1α染色较浅(B，白箭)； C、D.对照组VEGF染色较深(C，黑箭)，治疗组大鼠VEGF染色较浅(D，白箭)； E、F.对照组mtp53染色深(E，黑箭)，治疗组mtp53染色较浅(F，白箭)

VEGF是调节血管生成的主要因子，受多种细胞因子调控；高表达的HIF-1α蛋白可大量激活VEGF转录，从而促使局部组织新生血管形成。VEGF通过与VEGF受体1/FAM 样酪氨酸激酶1和VEGF受体2 /胎肝激酶1特异性结合，激活并诱导血管内皮细胞进行有丝分裂，从而增殖产生大量血管内皮细胞[19]。Li等[20]研究报道，VEGF在正常人外阴表皮内少部分区域呈弱阳性表达，而在VIN患者外阴表皮内大部分区域呈强阳性表达。本研究结果显示，与对照组比较，治疗组大鼠外阴皮肤中VEGF表达明显降低，提示聚焦超声治疗可减弱VEGF表达，从而在一定程度上减少LSIL局部新生血管形成。

p53基因被认为是人类基因组的“守护者”，其中野生型p53基因具有较强的抑癌功能，而mtp53基因不但丧失了抑癌功能，还可通过激活下游各类靶基因解除对细胞周期的调控，促进细胞增殖并提高细胞存活率，从而促进肿瘤的发生、发展[21]。侯学涛等[22]研究报道，正常外阴组织发生外阴鳞状上皮内病变至进展为外阴鳞状细胞癌过程中，mtp53蛋白阳性表达率逐渐升高；表明mtp53与外阴鳞状上皮内病变的发生有关，检测mtp53表达有助于早期诊断外阴恶性病变。本研究结果显示，治疗组大鼠外阴皮肤中mtp53表达较对照组明显降低。

总之，聚焦超声治疗大鼠外阴LSIL安全、有效，超声辐照后大鼠外阴皮肤中HIF-1α、VEGF及mtp53表达降低可能为其作用机制。