猪产气巴氏杆菌广东株的分离鉴定及其16S rDNA 基因序列遗传进化分析

陈胜男，翟颀，李垦科，张杰，钟汝情，陈晓倩，谢莹，焦思思，冉承峰，翟少伦**，邹育根**

（1.广州中科基因检测服务有限公司，广州 510500；2.广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州 510640）

1974 年，美国科研人员从猪体内分离到一种类产气巴氏杆菌[1]。之后，这种细菌在加拿大、法国、捷克、比利时、丹麦、匈牙利、英格兰等多个国家发现报道，由于其生化特征相似，都呈现氧化酶和尿素酶阳性，还可以分解多种糖类产气，故而命名为产气巴氏杆菌（Pasteurella aerogenes）[2-7]。分类学上，产气巴氏杆菌是巴氏杆菌科（Pasteurella family）巴氏杆菌属（Pasteurella genus）的成员。临床上，多项研究表明其可与人和多种动物的流产、死胎、脊椎炎等密切相关[8-12]。

本研究从广东某猪场母猪产道分泌物中分离到一株革兰氏阴性小球杆菌，经16S rDNA 核苷酸序列比对分析鉴定为猪产气巴氏杆菌，并对分离株的药物敏感性、16S rDNA 遗传进化进行分析。具体报告如下：

1 病例描述

广东某猪场存栏母猪350 头，自2018 年6 月-11 月，一直出现母猪屡配不孕、流产等情况。为了弄清楚母猪繁殖障碍的原因，采集6 份母猪产道分泌物，待检。

2 细菌分离

6 份母猪产道分泌物分别接种血平板，经24 小时增菌培养，血平板上均出现1 种菌落，不溶血。经革兰氏染色，该菌呈现链状的小球菌（图1），命名为GD01 株。

3 药敏试验

采用药敏纸片法评估该菌的药物敏感情况，结果显示该菌对丁胺卡那霉素、恩诺沙星、阿莫西林克拉维酸钾、羧苄西林和新霉素高度敏感，对氨苄西林、庆大霉素、多西环素、卡那霉素和妥布霉素中度敏感，对氟苯尼考、阿莫西林、青霉素、四环素和复方新诺明低度敏感，而对林可霉素、大观霉素、链霉素、磺胺异噁唑和甲氧苄氨嘧啶表现耐药。

4 16S rDNA 序列扩增、克隆与分析

采 用 细 菌 1 6 S r D N A 通 用 引 物 (F:5’-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3’; R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)组建PCR 扩增16S rDNA 核酸序列，具体反应条件如下：95℃预变性5min，30 个循环（95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s），72℃再延伸7min。经PCR扩增，电泳分析显示，1%琼脂糖凝胶出现约1500bp 大小的目的片段(图2)。对片段进行克隆测序，获得1465bp 的核酸序列。在线Blastn 分析显示GD01 株与我国云南的猪产气巴氏杆菌菌株（ZY14013，GenBank 号：KM555273）同源性最高，达99.8%。由于GenBank 中产气巴氏杆菌16S rDNA 核酸序列长短不一，本文截取了相同区域的序列进行比对分析，结果显示GD01 株与瑞士的猪源产气巴氏杆菌（JF2011 株，GenBank 号：AF139577）同源性最高（99.9%），与美国的猪源产气巴氏杆菌（P-172-71 株，GenBank 号：NR_026032）同源性最低（98.5%）（图3）。在遗传进化树上，也可看出GD01 株与产气巴氏杆菌在同一分支，而与副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）332 株（GenBank号：AB370297）和麦氏巴氏杆菌（Pasteurella mairii）34310-72株（GenBank 号：AB370297）遗传关系较远（图4）。

5 讨论与小结

2014 年，我国首例猪产气巴氏杆菌感染病例是在云南省流产母猪群中报道，尽管分离株对小鼠有一定的致病性，猪样品中猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒、衣原体阴性，但其是否是引起猪流产的主要病原仍然未知[13]。本研究也在广东流产猪群中，分离到猪产气巴氏杆菌，所采集样本中猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒也是阴性。这进一步验证了猪产气巴氏杆菌是引起猪流产的重要潜在病原。亟需开展怀孕母猪群中的动物感染实验，来评定其致病性。█