特征性峰位法结合化学计量学构建奶粉脂肪含量定量模型

杨 泽， 冯佳丽， 张 宏, 马玉涵*， 赵 岩

(1. 安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100；2. 中国科学院 合肥物质科学研究院，安徽 合肥 230031)

奶粉是一种常见的乳制品,富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿质元素等多种营养物质[1]。奶粉中的脂肪含量是乳制品研究的重点之一,也是奶粉中的主要成分之一。相关研究显示，41种奶粉的平均质量分数为17.06%,在中老年和婴幼儿奶粉中含量最高,接近30%,而在女士奶粉及脱脂奶粉中含量较低,最低仅1.2%。在婴幼儿配方奶粉中,脂肪具有重要作用:(1)提供了40%～50%婴儿生长发育和维持健康需要的能量;(2)是脂肪酸的主要来源,构成机体的重要成分;(3)是脂溶性营养的重要载体[2]。

对奶粉营养物质的检测主要基于化学测定法,但其存在一定的弊端。如化学试剂使用会污染环境,检测往往需要比较复杂昂贵的检测仪器(凯氏定氮仪、高效液相色谱仪、原子吸收分光光度计等),检测费用和时间成本较高等[3]。除此之外,以间接产物为目标的检测方法会为不法分子掺假提供便利,比如此前引发了重大食品安全问题的三聚氰胺事件就是由于凯氏定氮法在检测中存在的漏洞所致[4]。

傅里叶变换中红外(FTIR)光谱具有检测速度快、操作简便、适合于高通量多种成分的快速分析,并具有指纹特征,可以对备选成分有效检测的同时对非法添加的成分进行判断识别。因此,FTIR光谱广泛应用于化学、材料科学、农业和食品科学领域[5]。红外光谱可分为近红外(1 333-4 000 cm-1)、中红外区(400-4 000 cm-1)和远红外区(10-400 cm-1)3个谱段[6]。大多数有机化合物和无机离子的基频振动吸收都落在中红外区内。因为化合物分子中所含的化学键或官能团不同,或者官能团所处的化学环境不同,所以振动能级从基态跃迁到激发态所需能量不同,因而会吸收不同波长的红外光,形成不同的红外光谱图[7]。FTIR光谱可以实现对物质某些特定基团的鉴定和指认,其吸收峰峰高(峰面积)与该基团的浓度成正比例关系,符合朗伯-比尔定律。因此,也可以利用FTIR光谱对物质进行定量分析[8]。基于此理论的最主要方法就是吸收峰峰高(峰面积)定量法[9]。但是这种定量关系存在一定的问题,最主要的就是对于复杂的多组分体系,FTIR光谱峰位往往会叠加,互相干扰,给定量分析造成不便[10]。

为解决这些问题，一种方法是对复杂体系的FTIR光谱进行分峰拟合,将一个宽峰经过变换,获得更为精细的峰位信息[11]。另一种方法是基于化学计量学的方法。随着计算机计算能力的提升,对大量光谱进行矩阵分析成为可能,也产生了多种算法实现对光谱的定量分析。其中应用最广的是偏最小二乘法(PLS)[12]。本试验利用光谱特征峰位法和PLS法对奶粉的脂肪含量进行定量分析,以分析二者在FTIR光谱定量分析方面的优劣,并将二者结合起来,以期获得更为高效稳定的定量分析模型。

1 材料与方法

1.1 供试材料

对市售的41种奶粉进行FTIR光谱分析,其中的奶粉包含了全脂奶粉、脱脂奶粉、高蛋白奶粉、高钙奶粉、中老年奶粉、婴幼儿奶粉等各个品类,脂肪含量呈现明显的梯度变化(表1)。

1.2 奶粉脂肪含量检测

实验严格按照GB 5413.3-2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》中盖勃乳脂计方法测定[13]。

1.3 试验方法

采用奶粉稀释氟化钙薄膜法,将各奶粉样品加蒸馏水充分溶解后,调整浓度为40 mg/mL,取15 μL滴加到CaF2红外光谱窗片上,40 ℃干燥过夜,将载有样品的CaF2红外光谱窗片上光谱仪检测。所用光谱仪为Perkin Elmer公司的Spectrum GX傅里叶变换红外光谱仪,DTGS检测器,分辨率为4 cm-1,扫描次数累加32 次。

表1 试验所用奶粉品牌及脂肪含量

1.4 FTIR光谱拟合

利用Peakfit 4进行特征峰区拟合;去卷积处理(Deconvolution);基线类型:Linear,D2;峰位类型:Gauss Amp;可变宽度。

1.5 数据分析

FTIR光谱利用OPUS 7.0软件进行基线校正、矢量归一化和PLS定量模型构建;线性回归利用IBM SPSS 19计算分析;Origin Pro 2016绘图[14]。

2 结果与分析

2.1 奶粉的FTIR光谱图

奶粉的FTIR光谱如图1所示,特征性峰位的归属见表2。其中脂肪的特征性峰位为2 925、2 855、1 745 cm-1。

图1 奶粉的FTIR光谱图

波数/cm-1基团归属 3 800～3 200O-H伸缩振动糖的吸收峰 2 925CH2的非对称伸缩振动(主要来源于脂肪) 2 854CH2的对称伸缩振动(主要来源于脂肪) 1 745C=O伸缩振动(主要来源于脂肪) 1 651酰胺I带C=O吸收峰(主要来源于蛋白质) 1 543酰胺II带的N-H和C-N吸收峰(主要来源于蛋白质) 1 456CH2/CH3弯曲振动(脂肪、蛋白质) 1 200～1 030C-O伸缩振动 930～900环振动

2.2 奶粉脂肪FTIR光谱特征性峰位的确定

通过对普通奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉、婴儿奶粉FTIR光谱分析,我们发现,奶粉脂肪含量在2 925、2 855、1 745 cm-1峰位有显著差异,上述峰位在25号婴儿配方奶粉>7号伊利全脂奶粉>1号完达山益生元中老年奶粉>5号完达山脱脂奶粉(图2)。此结果证实了表2结论,并体现出上述峰位峰高与脂肪含量之间似乎存在剂量依赖关系。

图2 普通奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉和婴儿奶粉的FTIR光谱比较

2.3 奶粉FTIR光谱脂肪特征性峰的峰高和峰面积拟合计算结果

为对此剂量依赖关系进行定量分析判断,对41种奶粉FTIR光谱进行峰位拟合处理,以1号完达山益生元中老年奶粉为例,其峰区拟合结果如图3所示。结果显示,脂肪含量与2 925、2 855、1 745 cm-1峰位的积分面积和峰高均存在相关性,且各峰峰高和峰面积之间也存在相关性(P<0.001)(表3),其线性回归分析方程结果如所示。

图3 完达山益生元中老年奶粉FTIR光谱2 750～3 000 cm-1和1 500～1 800 cm-1光谱拟合图

脂肪含量2 925 cm-1峰面积2 925 cm-1峰值2 855 cm-1峰面积2 855 cm-1峰值1 745 cm-1峰面积1 745 cm-1峰值 脂肪含量 2 925 cm-1峰面积0.749∗∗ 2 925 cm-1峰值0.815∗∗0.985∗∗ 2 855 cm-1峰面积0.762∗∗0.947∗∗0.950∗∗ 2 855 cm-1峰值0.799∗∗0.981∗∗0.993∗∗0.962∗∗ 1 745 cm-1峰面积0.725∗∗0.848∗∗0.881∗∗0.8080.862∗∗ 1 745 cm-1峰值0.818∗∗0.948∗∗0.989∗∗0.942∗∗0.988∗∗0.873∗∗

Fat Content=6.937+14.975×Area1 745+6.661×Area2 855-6.29×Area2 925

(回归方程1)

Fat Content=6.979+1 054.486×Height1 745-419.825×Height2 855+104.62×Height2 925

(回归方程2)

(回归方程1)R=0.83,R2=0.688 3;(回归方程2)R=0.831,R2=0.688 5。

以上述公式计算的奶粉脂肪含量计算值和真值(表1)比较,其对应关系如图4所示。可以看出,虽然脂肪含量与2 925、2 855、1 745cm-1峰位的积分面积和峰高存在较强的相关性,但通过简单的线性回归获得的方程1和2计算值与真实值之间仍存在着比较明显的差距。说明仅仅以特征峰位法构建奶粉的脂肪含量方程效果不甚理想。

图4 由线性回归公式获得的奶粉脂肪含量计算值和真值对应图(a)峰积分面积;(b)峰高

2.4 奶粉FTIR光谱脂肪含量PLS定量自动优化模型

为改善FTIR光谱定量分析效果,尝试利用化学计量学手段,以OPUS软件的自动优化功能,获得的PLS法构建脂肪含量的定量模型,结果如图5所示。从此图可以看出,定量模型的R2=0.943,RMSECV=1.71,RPD=3.88,维数=10。虽然获得了较高的R2值和较低的RMSECV结果,但从RMSECV/维数结果可以看出,该模型很不稳定,在样本扩大的情况下可能会造成定量误差增大。该定量模型的光谱范围为(3 689.33～376.9)+(3 070.32～757.8)+(2 449.32～138.8)+(1 521.6～900.6) cm-1,范围分散,说明该自动优化模型没有能够特异性的选择与脂肪相关的特异性峰位,造成了定量模型维数的过饱和现象。

图5 奶粉脂肪含量FTIR自动优化定量模型

2.5 基于奶粉脂肪特征峰位的FTIR光谱脂肪含量定量分析模型

为改善定量分析模型的分析效果,避免光谱范围选择的过饱和现象,我们以脂肪特征性的2 925、2 855、1 745 cm-1峰位作为备选峰位,经过优化,获得了新的定量分析模型。所选用的光谱范围为(2 997-2 781)+(1 795.5-960.4) cm-1,预处理方式为一阶导数+多元散射校正。校正集计算结果如图6所示。从上图可以看出,定量模型的R2=0.931,RMSECV=1.69,RPD=4.01,维数=6,其RMSECV/维数呈现平滑下降曲线,模型稳定,分析效果理想。

图6 奶粉脂肪含量FTIR定量模型

3 结论与讨论

现有的检测奶粉脂肪的方法包括罗兹·哥特里法、索氏提取法、巴布考克法、盖勃氏乳脂计测量法、色谱技术等[15]。但上述方法实验操作复杂,仪器设备昂贵,实验试剂对环境会造成污染,不适应常规快速高通量的质检检测,光谱分析技术可以有效避免上述缺陷,是具有潜在应用价值的适宜方法[16]。常用用于乳制品定性和定量分析的光谱技术包括中红外光谱和近红外光谱[15-17]。

中红外光谱特征性峰位特征明显,以往主要用于物质的鉴定和定性分析,但最近随着计算机技术的发展和化学计量学的进步,开展了越来越多的定量分析尝试。主要包括两大类,第一类是对特征性峰区面积、峰高等根据朗伯-比尔定律进行回归分析,例如杨妮娜等[18]利用特征性峰面积方法对傣药灯台叶中药用成分含量进行测定,朱亚明等[19]用分峰拟合法定量分析精制煤沥青热转化过程的结构变化等。第二类是利用化学计量学手段,采用PLS、神经网络、主成分分析、支持向量机等方法对中红外光谱进行定量分析。例如吴迪等[15]利用LS-SVM方法对奶粉脂肪含量予以分析,赵岩等[20]利用PLS方法对酸奶中的营养成分加以定量等。二者在定量方法和原理上存在一定的差异,本文对两种方法进行比较后结合使用,为奶粉脂肪的FTIR光谱定量分析方法的优化做了尝试。

从实验结果可以看出,脂肪含量与2 925、2 855、1 745 cm-1峰位的积分面积和峰高存在较高的相关性,其相关系数均大于0.7,且上述峰高和峰面积之间也存在共线性关系。利用此峰高和峰面积获得了2个回归方程,这两个回归方程的R=0.832,R2=0.688 3和R=0.831,R2=0.688 5。说明该回归方程能够对奶粉脂肪含量做适当的定性判断,但尚无法达到合理的定量判断能力。这说明对于奶粉这样的复杂体系而言,单纯依靠特征峰的面积或者峰高尚无法得到非常可靠的定量模型。从真值和计算值的对应关系来看,该公式对脂肪含量较高的奶粉预测效果较差。这提示有些脂肪信息未得到有效提取,需要对光谱范围适当扩展。

但过宽的光谱范围也可能对定量计算结果造成不利影响。虽然吴迪等对奶粉脂肪含量的中红外光谱全谱范围(4 000-400 cm-1)以LS-SVM构建定量模型,其维数为8,R2=0.955 6,RMSECV=1.666 8[15]。但本研究发现,如果对全谱范围以PLS构建定量模型,其R2=0.642 8,RMSECV=4.12,其RMSECV/维数结果不稳定,尚不及线性回归方程计算效果。

利用OPUS软件自带的自动优化功能,所获得的定量分析模型虽然有较高的R2值,较低的RMSECV结果,但选定的维数过高,选择维数过饱和,模型不够稳定。而以脂肪的特征性峰位为基础,优化获得的定量分析模型有更低的维数,更加稳定的分析效果,其R2=0.931,RMSECV=1.69,RPD=4.01,维数=6,可以对奶粉的脂肪含量做比较准确的定量分析。