唐菖蒲响应电子束转靶X射线辐照的生物学效应和辐射敏感性评价

黎熠睿 王 丹 湛晓蝶 许程航 徐龙水 邓善文 陈 浩

(1 西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621000；2 四川省辐射诱变技术育种平台，四川 成都 610000；3 四川省原子能研究院，四川 成都 610000；4 西南科技大学 国防科工委核废物和环境安全国防重点学科实验室，四川 绵阳 621000)

唐菖蒲(Gladiolusgandavensis)为鸢尾科唐菖蒲属多年生草本花卉，具有极强的观赏性，是重要的鲜切花生产材料，市场需求量逐年增加[1]。但目前，全球唐菖蒲新品种数量和种球质量明显下降，因此，唐菖蒲新品种的选育具有重要意义[2]。

研究表明，利用X射线、γ射线、中子等辐射处理能明显改善植物的多种农艺性状[3-5]。同时，电离辐射具有强穿透力[6]，能增加遗传多样性[7]、引入随机性可遗传变异[8-9]等特点，在观赏植物中应用广泛，是有效的改良方式[10]。有研究发现，经辐射处理的植株易发生花和叶的颜色、形状、大小和生长习性等表型特征的变化[11]。近年来，已有关于唐菖蒲辐射诱变育种的研究报道，如乔勇[12]通过60Co-γ射线辐射唐菖蒲诱变出4种花色和叶色变异植株；张志伟等[13]证明电子束辐射可用于唐菖蒲新品种培育；Patil等[14]通过γ射线辐射唐菖蒲获得1个穗型突变体和3种花色变异株。可见，辐射诱变育种技术已成为观赏性强的花卉品种选育和性状改良的重要技术[15-16]。

电子束转靶X射线是一种新型的辐射诱变技术，是高能电子束轰击重金属骤然减速产生的韧致辐射X射线[17]，其通过辐射可对生物体细胞产生直接和间接的生物学损伤效应[18]，且损伤类型多样。该方法可有效利用电子加速器，具有剂量准确、加工快、无放射源等优点，有效解决了电子束辐照穿透力弱的劣势[19]，在物理、材料、食品等领域[20]已有相关研究报道，但在观赏植物育种中尚鲜见报道。本研究系统地分析了X射线对唐菖蒲的辐射生物学效应，以期为唐菖蒲新品种选育和观赏性状改良提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

唐菖蒲种球(购于四川贝拉园艺有限公司)，无病虫害，种球直径均在2.8～3.2 cm之间，品种分别为道兰(Dowland)、柏辽兹(Berlioz)、贝多芬(Beethoven)、湖岸(Lakeland)、白色昌盛(White prosper)。

1.2 方法

1.2.1 辐射处理 在四川省原子能研究院开展电子束转靶X射线(以下简称X射线)辐射处理，辐射剂量分别为0(CK)、25、50、75、100 Gy，能量为2 MeV，流速为10 mA，每个品种各辐射剂量分别处理14个种球，每处理均设3次生物学重复，辐射处理完成后进行盆栽试验。

1.2.2 栽培管理 按照裂区随机区组试验盆栽摆放要求，采用长40 cm、宽14 cm、高17 cm的方形塑料花盆栽种，每盆种植7个相同品种的唐菖蒲种球。采用营养土体积配比为植物栽培专用土∶发酵有机基质∶腐叶土∶蛭石=5∶2∶2∶1，拌土时加入多菌灵；二叶期、三叶期、花芽分化前后分别追加复合肥1次，每盆施加复合肥10 g。M0种球(母球)生长的植株限定为VM1；VM1种球完成一个生长周期，分别收集母球和子球，子球栽种后生长的植株为VM2。统计唐菖蒲各品种VM1、VM2种球经不同辐射处理后的发芽率，测定VM1、VM2植株的生长指标。

1.2.3 发芽率及生长指标的测定 VM1、VM2不同唐菖蒲种球，均栽种30 d后开始检测数据，测定时将种球萌发露白或芽已转绿即视作发芽，统计并计算发芽率和种球繁殖率：

发芽率=出芽种球数/总种球数×100%

(1)

种球繁殖率=VM2种球数/VM1种球数×100%

(2) 。

出芽生长60 d后开始测定每组植株的生长指标(VM1测量各处理所有存活植株，VM2各处理随机选取3株测量)。统计并计算VM1、VM2的变异率：

变异率=变异植株数/总存活植株数×100%

(3) 。

各变异类型植株随机选取3株进行叶绿素检测、叶片微观观察等。开花后，统计或检测各品种单株开花数、花单朵直径、花茎长、花序长、花粉形态等性状。具体测定方法如下：

采用精确度为0.01 mm的BS153015电子数显卡尺 (宁波世际波斯工具公司)测量VM2种球最大直径；株高为植株顶部至土表的垂直距离；参照石景荪等[21]的唐菖蒲叶面积测定法，测定叶片长、宽值，构建叶面积回归方程，计算植株总叶面积；去除叶片尖部与基部，参照王学奎等[22]的方法，利用UV8000s紫外分光光度计(上海元析仪器公司)测定叶片叶绿素含量；采用EVO18扫描电镜(德国蔡司仪器公司)进行叶片表面形态观察，打孔法采样，取变异植株叶片中部位置，冷冻干燥12 h，喷金后测样；采用EVO18扫描电镜取未开放的VM2植株花蕾花粉进行花粉扫描电镜观察，冷冻干燥12 h，喷金后测样；以花瓣露出花被为标准计数，统计单株开花数；以左右两侧对称花瓣的总长为花朵直径，用直尺测量花径长；以花序顶部至最后一片叶片分叉处为花茎，用直尺测量花茎长；以花序顶部至下部最后一朵花的基部为花序长度，用直尺测量花序长度。

1.2.4 半致死剂量计算 半致死剂量的计算方法参照王静等[23]和周亚倩等[24]的方法，根据统计出的发芽率构建半致死剂量回归方程。不同品种唐菖蒲分别以电子束转靶X射线辐射剂量为横坐标，发芽率为纵坐标拟合y=ax+b的线性方程，计算发芽率为50%时的辐射剂量，从而确定半致死剂量。

1.3 数据分析

采用SPSS 23.0、Origin 9.0、Microsoft Excel 2010等软件对数据进行分析，数据均为3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 X射线辐射对唐菖蒲种球的影响

2.1.1 不同辐射处理对VM2种球繁殖率的影响 由表1可知，经X射线辐射后，各辐射处理的道兰、湖岸、柏辽兹繁殖率均显著高于CK，且均在25 Gy处理时种球的繁殖率最高，分别较CK高23.81、16.67、24.01个百分点，继续增大辐射剂量，3个品种的繁殖率均降低，但仍高于CK，表明25～100 Gy的电子束转靶X射线辐射处理对唐菖蒲种球的繁殖有促进作用。25 Gy和75 Gy处理时的贝多芬种球繁殖率均显著高于CK，50 Gy和100 Gy处理时种球繁殖率也高于CK，但差异不显著。白色昌盛繁殖率与辐射剂量呈负相关，50～100 Gy处理显著低于CK，100 Gy处理时繁殖率降至58.10%。

表1 X射线辐射对不同品种唐菖蒲VM2种球繁殖率的影响Table 1 Effects of X-ray radiation on the breeding rate of VM2 gladiolus bulb of different varieties /%

注：同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.

2.1.2 不同辐射处理对VM2种球直径的影响 由表2可知，25～50 Gy处理下，各品种的VM2种球直径均大于CK。25 Gy处理下，道兰、湖岸、柏辽兹、白色昌盛和贝多芬的VM2种球直径均达到最大值，分别为34.41、32.86、39.08、32.64和41.18 mm，且显著高于CK，表明低剂量的X射线辐射处理可有效增加唐菖蒲种球的球径。75～100 Gy处理下，湖岸、柏辽兹和白色昌盛的VM2种球直径显著低于CK，表现出明显的辐射损伤效应，且100 Gy处理的VM2种球直径最小；道兰、柏辽兹和贝多芬在75 Gy和100 Gy剂量处理间差异不显著，表明X射线达到一定阈值后抑制效应会减弱或趋于稳定。

表2 X射线辐射对不同品种唐菖薄VM2种球直径的影响Table 2 Effects of X-ray radiation on the diameter of VM2 gladiolus bulb of different varieties /mm

2.2 X射线辐射对唐菖蒲生长的影响

2.2.1 不同辐射处理对VM1、VM2发芽率的影响 由表3可知，经X射线辐射后，与CK相比，不同辐射处理对5个品种唐菖蒲VM1的发芽率均无显著影响，且各辐射处理下唐菖蒲VM1的发芽率均较高；辐射处理对唐菖蒲VM2发芽率的延续性影响较大，各辐射处理间差异显著。25 Gy处理下，道兰、湖岸、柏辽兹、白色昌盛和贝多芬VM2的发芽率均达到最大值，分别为96.33%、86.96%、93.78%、87.33%、97.52%，且显著高于其他处理，说明25 Gy处理对唐菖蒲VM2发芽率具有明显的促进作用，且该作用从VM1延续至VM2；50～100 Gy处理下，随着辐射剂量的增加，各品种VM2的发芽率均逐渐降低，在100 Gy处理时达到最小值，表明X射线的辐射损伤效应具有滞后性。湖岸和白色昌盛VM2的发芽率在50 Gy处理时，达到半致死剂量；道兰、柏辽兹、贝多芬VM2的发芽率在75～100 Gy之间可导致半致死。对辐射剂量与VM2的发芽率进行相关性回归分析，预测半致死剂量，结果表明，道兰、湖岸、柏辽兹、白色昌盛和贝多芬VM2发芽率的半致死剂量分别为78.00、48.24、87.07、47.69和86.81 Gy。由此可知，5个品种对X射线的辐射敏感性由弱到强依次为柏辽兹<贝多芬<道兰<湖岸<白色昌盛。

2.2.2 不同辐射处理对VM1、VM2株高与叶面积的影响 由图1-A、B可知，不同辐射处理下，不同唐菖蒲品种VM1、VM2的生物学效应存在差异，但总体上均表现出低促高抑的现象。25～50 Gy处理对湖岸、柏辽兹和贝多芬3个品种VM2株高有显著促进作用(P<0.05)，50 Gy处理后略有下降，但25 Gy和50 Gy处理间差异不大，而后随着辐射剂量的增加，VM2株高均逐渐降低，而湖岸在 100 Gy 处理时的株高仍略高于CK，但与CK差异不显著(P>0.05)，贝多芬在100 Gy处理时的株高略高于75 Gy，但处理间差异不显著(P>0.05)。道兰VM1在50 Gy处理时株高达到最大值，为60.37 cm，随后株高逐渐降低，但在100 Gy处理时株高与CK差异不显著，说明低于100 Gy的X射线辐射可促进道兰的生长，其中，50 Gy处理效果最佳。白色昌盛VM1的株高与辐射剂量呈负相关，剂量越高抑制越严重，其辐射耐受性较低。与唐菖蒲VM1的株高相比，不同品种VM2植株的株高在同一剂量处理下均有所降低。湖岸、柏辽兹和贝多芬VM2植株在25 Gy处理时株高达到最高，道兰和白色昌盛VM2植株在50 Gy处理达到最高，100 Gy处理时唐菖蒲VM2的株高受抑制程度增加。

图1 X射线辐射对不同唐菖蒲品种VM1、VM2株高和叶面积的影响Fig.1 Effects of X-ray radiation on VM1 and VM2 plant height and leaf area of different gladiolus varieties

由图1-C、D可知，不同品种VM1、VM2的叶面积变化趋势相同，除白色昌盛VM1在50 Gy处理时达到最高，其余4个品种在25 Gy处理时达到最大值；5个品种在100 Gy时均最小，且VM2辐射损伤表现出来的抑制作用更加明显，道兰、湖岸、柏辽兹、白色昌盛和贝多芬VM2的叶面积较VM1分别减少11.65、47.93、60.17、137.74、42.47 cm2。上述研究表明，高剂量辐射处理对植株的抑制作用具有延续性。

2.3 X射线辐射对VM2叶形态及叶色变化的影响

2.3.1 不同辐射处理对VM2叶片形态的影响 由图2可知，经50～100 Gy处理后的植株易发生形态变化。以湖岸、柏辽兹和贝多芬为例，50～100 Gy处理后，湖岸和柏辽兹发生了较明显的叶色变异，主要表现为叶片呈嫩黄色或黄绿相间、植株基部叶片短小且互相套迭、叶片相互粘连呈锥形、芽状苗(始终保持苗期的植株形态)。湖岸叶片形态变化主要集中在50～75 Gy处理，柏辽兹主要发生于50～100 Gy处理，贝多芬经75 Gy处理后株型变化较为明显，说明不同品种唐菖蒲的植株形态变化主要出现在VM2，证明X射线的辐射生物学效应具有滞后性。

注：a:湖岸叶片短小且互相套迭(75 Gy)； b：湖岸叶黄色(50 Gy)；c:柏辽兹叶黄绿条纹(50 Gy)；d:柏辽兹芽状苗(100 Gy)；e:贝多芬叶连呈锥形(75 Gy)。Note: a:The blade of the Lakeland is short and overlapping with each other(75 Gy). b: Yellow leaf of Lakeland (50 Gy).c: Yellow-green stripe of Berlioz leaf (50 Gy). d: Berlioz bulb is like bud(100 Gy). e: Beethoven leaf becomes cones(75 Gy).图2 X射线照射下唐菖蒲VM2突变体植株形态变化Fig.2 Plant morphology of gladiolus mutants in VM2 under X-ray irradiation

注：a：湖岸对照；a1、a2：湖岸变异植株；b：柏辽兹对照；b1、b2：柏辽兹变异植株；c：贝多芬对照；c1：贝多芬变异植株。Note:a: Lakeland control. a1,a2: Lakeland variant: b: Berlioz control. b1,b2: Berlioz variant. c:Beethoven control. c1: Beethoven variant.图3 VM2变异植株叶片扫描电镜微观图Fig.3 Scanning Electron Microscopy of the leaves of VM2 variant plants

利用扫描电镜进一步探讨导致叶片发生形态变化的原因，观察发现湖岸的叶片表面凸起消失(图3-a1)，凸起间的沟壑变浅(图3-a2)，气孔形态由长方形变为椭圆形；柏辽兹和贝多芬叶面凸起逐渐平滑(图3-b1、c1)且形状发生不规则变化(图3-b2)，部分气孔形态由长方形逐渐转变为正方形(图3-b1、b2)。

2.3.2 不同辐射处理对VM2叶色变化的影响 针对图2发现的5种唐菖蒲VM2突变体植株形态变化(叶色黄绿相间、叶片黄化、叶节间缩短套叠、叶间粘黏、芽状苗)，每个品种均取3株长势一致的唐菖蒲VM2突变体植株进行叶绿素含量检测。由表4可知，变异植株主要集中在50～100 Gy处理，且叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均低于CK，叶黄绿相间的植株叶绿素a+b含量为0.427 mg·g-1，芽状苗变异植株叶片的叶绿素a+b含量为0.603 mg·g-1，叶节间缩短变异植株叶片的叶绿素a+b含量为1.031 mg·g-1，叶粘黏变异植株叶片的叶绿素a+b含量为0.868 mg·g-1，叶片黄化变异植株叶片的叶绿素a+b含量仅为0.287 mg·g-1，明显低于CK。表明高剂量(50～100 Gy)的X射线辐射损伤效应在VM2发生且表现明显。

2.4 X射线辐射对VM2唐菖蒲开花的影响

2.4.1 不同辐射处理对VM2开花性状的影响 由表5可知，经X射线辐射处理后的唐菖蒲VM2中仅道兰和柏辽兹的CK和25 Gy处理开花，其余处理均未开花。25 Gy处理后道兰和柏辽兹的开花性状均优于CK，花朵数分别增加2、3朵，花直径分别增加3.26、2.53 cm，花茎增加9.12、37.46 cm，花序长分别增加9.07、25.76 cm，主要表现为花朵数增加、花大茎长。

2.4.2 不同辐射处理对VM2花粉微观形态的影响 由图4可知，正常情况下，唐菖蒲的花粉粒表面光滑且呈饱满球形(图4-a、b)，而经X辐射处理后的VM2开花植株花粉粒出现表皮破裂(图4-a1、b2)、中空(图4-b1、a2)、干瘪(图4-a3、b3)等现象。说明X射线辐射会破坏其基本形态，对花粉粒造成不可逆的生物学损伤。

表4 X射线辐射后唐菖蒲变异植株的叶绿素检测Table 4 Detection of chlorophyll in gladiolus mutated plants after X-ray irradiation

注：“-”表示无。

Note:‘-’ means none.

表5 X射线辐射后唐菖蒲VM2的开花性状Table 5 Statistics of flowering characters of VM2 gladiolus after X-ray irradiation

注：a：道兰对照；a1,a2,a3：道兰25 Gy处理下开花植株花粉；b：柏辽兹对照；b1,b2,b3：柏辽兹25 Gy处理下开花植株花粉。Note: a: Dowland control. a1,a2,a3: Pollen of flowering plants of Dowland treated with 25 Gy.b:Berlioz control. b1,b2,b3: Pollen of flowering plants of Berlioz treated with 25 Gy.图4 唐菖蒲VM2花粉粒扫描电镜微观图Fig.4 Scanning electron microscopy of pollen grains of VM2 gladiolus

3 讨论

辐射诱变育种具有操作方法简便、突变率高、育种年限短等优点[7]。本研究首次将电子束转靶X射线运用于唐菖蒲辐射育种中，通过对VM1、VM2植株各指标的检测发现，电子束转靶X射线能明显影响唐菖蒲VM2种球的繁殖率、种球直径等，且表现为低剂量(25 Gy)辐射处理有益于种球繁殖、球茎膨大、种球发芽，高剂量(75～100 Gy)辐射处理后种球膨大和发芽均受到抑制。Cammaerts等[25]研究表明，低剂量辐射处理可以有效打破十字花科种子休眠，促进种子萌发，高于某个辐射阈值后，发芽率随辐射剂量的增加而逐渐降低，或出现种子发芽滞后的现象，这与本研究结果一致。本试验中VM1种球发芽率受辐射影响不明显，VM2种球的发芽率在25 Gy处理时的发芽率显著高于对照，50～100 Gy时发芽受抑制明显，说明电子束转靶X射线辐射后的生物效应存在潜伏期和滞后性，且剂量越高，致死现象越严重，与Jan等[26]的研究结果一致，且该现象可能与辐射剂量和生物体的内在辐射敏感性相关[27]。

辐射敏感性是指辐射对物体的可识别效应的数量，是细胞代谢活力的表现，与植物的营养状况存在一定的关系[28]，其中半致死剂量是衡量植物对辐射敏感性的重要指标。大量研究表明，半致死剂量可以通过根系生长情况[29]、存活率[23]、萌发率[24]等指标测定。本研究以唐菖蒲VM2种球发芽率作为半致死剂量检测指标，通过建立半致死剂量回归方程得出道兰、湖岸、柏辽兹、白色昌盛和贝多芬5个品种的半致死剂量分别为78.00、48.24、87.07、47.69和86.81 Gy，即5个品种对电子束转靶X射线的辐射敏感性最弱为柏辽兹，最强为白色昌盛，表明辐射敏感性因品种、组织器官、生长阶段等的不同而存在差异，与前人研究一致[30-31]。此外，任少雄等[32]提出诱变育种的最适剂量与半致死剂量接近，本研究虽已找出5个唐菖蒲品种在X射线辐射下的半致死剂量，但各品种的半致死剂量是否是电子束转靶X射线辐射的最适剂量还需进一步研究。

研究表明，低剂量辐射处理可促进种子的萌发[33]，增强植株抗逆性[34-35]，提高植株的生长发育能力[36]等。本研究发现，经25 Gy X射线辐射处理后，VM1、VM2种球萌发和植株生长状态良好，且VM2开花植株开花性状优于对照，表现为花大、花数多、花序长，说明低剂量的X射线辐射可以作为改良物种的一种途径，这与Singh等[37]的研究结果一致。

此外，本研究还发现50～100 Gy电子束转靶X射线对植物的生长有致死效应，高剂量辐射处理后的VM2植株的生长情况明显较VM1植株差，表现出明显的辐射损伤滞后现象；同时，在该辐射区间内VM2植株出现较多的形态变异，说明适宜的辐射剂量能够诱发更多的变异，这与李风童等[38]的研究结果一致。本研究对5种不同形态的变异植株进行叶片微观形态和叶绿素含量检测，发现经辐射处理后的VM2叶片表面的凸起和气孔形状改变，植株叶绿素含量降低，从而推测产生变异的原因可能是经X射线辐射处理后，植株叶绿素、淀粉和蔗糖代谢受到干扰，新生细胞缺少可供营养造成的[39]，也可能是X射线辐射对植物细胞产生的损伤效应导致唐菖蒲叶型或株型的变异[40-42]。但具体的结论还有待进一步深入研究。

4 结论

本研究结果表明，25 Gy辐射处理有利于唐菖蒲VM2种球的萌发和膨大，能促进VM1、VM2植株的生长，可以作为改良唐菖蒲性状的方法。高辐射剂量(75～100 Gy)处理下，唐菖蒲各品种种球大小、繁殖率、发芽率、株高、叶面积等明显被抑制，且电子束转靶X射线辐射生物学效应具有滞后性。综合唐菖蒲各品种的半致死剂量和生长情况，得出辐射敏感性由弱到强依次为柏辽兹<贝多芬<道兰<湖岸<白色昌盛。本研究结果为唐菖蒲利用辐射诱变选育优良新品种提供了一定的理论依据。