荧光定量聚合酶链式反应法与酶联免疫吸附试验法在乙型肝炎病毒检测中的应用价值

谢玉娜

福建省龙岩市人民医院检验科 （福建龙岩 36400）

乙型肝炎病毒 （HBV）是一种嗜肝DNA病毒，乙型病毒性肝炎是一种传染性疾病，该病发病率极高，且传播途径复杂、感染率高、流行面广等，长期携带HBV可造成肝脏炎性损伤，诱发肝衰竭、肝硬化等疾病，且可引起肝细胞癌［1-2］。我国乙型病毒性肝炎的患病人数位居世界首位，严重危害人们的健康。因此，寻找一种快速有效的检测方式意义重大。荧光定量聚合酶链式反应 （FQ-PCR）法与酶联免疫吸附试验 （ELISA）法是临床常用的两种检测方式。本研究旨在探讨FQ-PCR法与ELISA法在HBV检测中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月至2018年6月我院接诊的248例疑似HBV感染患者为研究对象，男151例，女97例；年龄21～75岁，平均 （38．64±8．57）岁。排除出血倾向、凝血功能障碍，以及精神类疾病等患者。

1.2 方法

（1）ELISA法。采集入选患者2 ml空腹静脉血，进行10 min的3 500 r／min离心操作，取血清。使用Bio-Tek（ELX-808）酶标仪、PW-960Plus全自动酶标洗板机 （购自深圳汇松科技发展有限公司）和上海科华生物工程股份有限公司提供的试纸盒检测乙型肝炎标志物，包括乙型肝炎表面抗体（HBsAb）、乙型肝炎表面抗原 （HBsAg）、乙型肝炎e抗体（HBeAb）、乙型肝炎核心抗体 （HBcAb）、乙型肝炎 e抗原（HBeAg）。严格按照试纸盒说明书上步骤进行操作。经（A450～630 nm）计算吸光度值，或用酶标仪读取450 nm位置吸光度值，经吸光度值判定检测结果。（2）FQ-PCR法。采集入选患者2 ml空腹静脉血，放置在真空惰性分离胶促凝管内，进行10 min的3 500 r／min离心操作，以制备血浆标本，使用购自美国ABI公司7500型FQ-PCR仪、艾康生物技术 （杭州）有限公司提供的HBV核酸定量检测试剂盒检测HBV-DNA浓度。

1.3 临床评价

记录乙型肝炎核酸定量DNA的阳性率与HBsAb、HBsAg、HBeAb、HBcAb、HBeAg的阳性率。将ELISA法检测5项乙型肝炎标志物结果分为HBeAb、HBsAg、HBcAb阳性等 “小三阳”组与HBeAg、HBsAg、HBcAb阳性等 “大三阳”组，将两者的阳性率和乙型肝炎核酸定量DNA结果进行比较。判断标准：（1）FQ-PCR法，HBV-DNA浓度＜500 copies／ml为阴性，浓度≥500 copies／ml为阳性；（2）ELISA法，检测样本吸光度值临界值为1，当测定值＞1时结果评定为阳性，＜1时判定为阴性。

1.4 统计学处理

采用SPSS21．0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FQ-PCR法与ELISA法检测阳性率

FQ-PCR法与ELISA法检测HBV-DNA、HBsAb、HB-sAg、HBeAb、HBcAb、HBeAg阳 性 率 分 别 为 60．48%、43．95%、36．29%、15．32%、33．47%、6．45%。见表 1。

表1 FQ-PCR法与ELISA法检测阳性率 ［例 （%）］

2.2 HBV-DNA组与大、小三阳组检测阳性率比较

HBV-DNA组检测阳性率高于大、小三阳组，差异有统计学意义 （χ2=162．581、107．451，P=0．000、0．000）。见表2。

表2 HBV-DNA组与大、小三阳组检测阳性率比较 ［例 （%）］

3 讨论

乙型肝炎属于病毒性肝炎，有较强的传染性，HBV为主要病毒。我国携带HBV人数高达9 300万人，其长期潜伏于机体内，部分HBV携带者会因机体内HBV被激活而患乙型肝炎。乙型肝炎存在起病缓慢、病情迁延不愈、传染率高、传播途径广等特点，且大部分患者的临床症状不明显，就诊时已发展为晚期，患者需持续治疗，使其身体痛苦与经济上的负担大幅度上升。早期、高效的确诊，实施正确、有效的治疗，可防止病情进一步恶化，是提高患者生存率的关键。由于临床上大量使用抗病毒药物，大幅度增加了HBV变异株数量，增加了传统的HBV血清学检测难度，检测的敏感性、准确性和可重复性均存在缺陷。ELISA法为传统的检测HBV感染手段，可有效检测血清中特异性抗体和抗原，对患者是否感染HBV进行判断，且操作简单［3-4］。其检测结果受到多种因素的影响，如血清分离，标本保存；加样是否存在溅出、气泡；加样加在孔壁非包被区；洗板情况；孵育方式与时间等。ELISA法检测需要特殊设备、反应时间长，且难以定量分析病毒的量与感染程度，不适用于无偿献血及门诊、急诊初筛工作。FQ-PCR法融合了DNA探针杂交与PCR两种技术，可经闭管检测与荧光技术直接探测到荧光信号在PCR过程中的变化，定量、定性分析HBV感染患者的感染程度［5］。

HBeAg是判断血清是否存在传染性的主要指标，而HB-sAg是诊断健康携带者与急性乙型肝炎患者的主要指标。HBeAg、HBsAg、HBcAb三者阳性 （大三阳）表示患者机体内HBV-DNA传染性强、复制率高［6］。本研究结果显示，HBV-DNA组检测阳性率高于大、小三阳组，提示FQ-PCR法检测价值高于ELISA法，可较好地判断患者是否处于HBV感染期。FQ-PCR法是以每毫升的拷贝数定量地发出检测报告，可准确、真实、可靠、定量地反映HBV-DNA浓度。FQ-PCR法可经分子水平对HBV-DNA浓度进行直接检测，可直观体现HBV活动性、存活与复制水平以及传染性［7］。本研究小三阳组的阳性率较低，提示该组存在少量传染性不强、复制较弱的HBV，可能与基本核心及前C区启动子区变异而形成终止密码子有关，因其处于感染潜伏状态，需积极监测病情，并及时实施抗病毒治疗。大三阳组的阳性率最低，提示大量存在传染性强、高度复制的HBV，临床需及时确诊，并对患者实施足量、长期的抗病毒治疗。FQ-PCR法检测HBV-DNA也存在一定的不足，如无法反映机体经病原体入侵后，抗体如何做应答及其结果；无法检测出病原体的数量等，难以取代血清学标志物的地位，但因其具有检测结果可靠、高敏感度等优点，可真实反映病毒DNA复制情况和HBV感染状态，可为判断乙型肝炎传染性、早期诊断、治疗监测，以及评估病情转归提供参考依据，必要时可使用ELISA法与FQ-PCR法联合检测，进一步提升诊断准确性，进而提高治疗有效性，改善患者预后。

综上所述，与ELISA法相比，FQ-PCR法可直观反映肝细胞内HBV复制情况。