右美托咪定对NF-κB信号通路的影响

张 奇，阚红莉*，刘铁成

（1.吉林省肿瘤医院麻醉科，长春 130012；2.吉林大学第二医院麻醉科，长春 130041）

右美托咪定是一种新型的α2-肾上腺受体激动剂，它在麻醉镇静和镇痛方面的辅助作用已经得到广泛的肯定，同时它对血流动力学影响比较小也是优点之一。许多报道证实α2-肾上腺受体与免疫细胞增殖和功能调节有关，因此本文主要围绕NF-κB 信号通路阐述α2-肾上腺受体激动剂右美托咪定能否影响免疫因子的调节和表达。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK293T 细胞株，Raw cell 264.7 细胞株，IKbα 多克隆抗体（santa），RT-pcr 试剂盒（takara）等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HEK293T使用DMEM培养基培养，加10% FBS 和1%抗生素，每24 h 换液，48 h 使用胰酶消化传代，保证细胞有规律的传代生长和健康的状态。

1.2.2 reporter assay 使用磷酸钙转染方法对HEK293T进行瞬时转染，24 孔每孔转染NF-κB reporter 质粒50 ng，2 M cacl2 2.5 μL，2*HBS 20 μL，充分混合后均匀加入每孔内。

1.2.3 RT-pcr TRIZOL 试剂进行总RNA 提取，使用biorad 公司的逆转录试剂盒进行cDNA 合成，最后使用TAKARA 公司的SYBR 试剂进行基因检测。

1.2.4 western bloting Raw cell 264.7 细胞经50 nM 右美托咪定处理以后检测IKbα 的表达水平。

2 实验结果

2.1 不同浓度的药物对HEK293T 细胞的影响 12 孔培养板，每孔1×105，过夜培养18 h 后，用磷酸钙法瞬时转染细胞，24 h 后分析基因表达的结果。实验结果说明随着药物剂量的增加HEK293T 细胞内Nf-κB 基因表达出现激活现象，可以间接促进下游的免疫分子的表达和增加。见图1。

2.2 右美托咪定对Nf-κB 基因mRNA 水平的影响 6孔培养板，每孔3*105，培养14 h 后药物处理10 h，更换培养基继续培养48 h，每孔细胞使用1ml trizol裂解，总rna 提取，进行rt-pcr 分析，实验结果说明高浓度的右美托咪定可以增强Nf-κB 基因mRNA 水平的表达。见图2。

2.3 右美托咪定对IKBα 表达的影响 Raw cell 264.7细胞在6 孔培养板中培养18 h 后使用不同浓度的Dex 处理10 h，继续培养24 h 后裂解细胞，去上清做western bloting 分析，结果说明药物浓度增加促进ikbα的降解，从而间接促进Nf-κB 的活化和入核，激活下游基因的表达。见图3。

图1 Nf-κB 基因表达与右美托咪定药物剂量的相关性

图2 不同浓度药物对Nf-κB 基因mRNA 水平的影响

图3 药物浓度对Raw cell 264.7 细胞IKBα 表达的影响

3 讨论

近年来研究发现α2-肾上腺受体激动剂在淋巴细胞酸右美托咪定近年来作为临床麻醉中广泛应用的α2-表面广泛分布，可以参与调节淋巴细胞的功能。盐肾上腺受体激动剂，其镇静和镇痛效果以及稳定性已经得到证实。右美托咪定作用于脑和脊髓的α2肾上腺素能受体（α2-AR），与美托咪定相比，本品对中枢α2-肾上腺素受体激动的选择性更强，对α2-肾上腺素受体的亲和力是可乐定的8 倍[1]。通过激动中枢神经系统α2受体最密集的区域：脑干蓝斑核（其主要作用是负责调解觉醒与睡眠），进而引发并维持自然非动眼睡眠（NREM）状态[2]，产生镇静、催眠作用，α2c 受体在这一过程中被激动并参与抗焦虑作用。作用机理可能为：1）由百日咳毒素敏感的G 蛋白介导，使神经元细胞超极化来抑制神经元放电，激活K+通道，同时抑制电压门控式Ca2+通道[1,3]；2）作用于中枢神经突触前与突触后α2-AR，抑制去甲肾上腺素（NE）释放，降低突触后膜的兴奋性[4-6]；3）通过抑制腺苷酸环化酶活性，减少细胞内环磷酸腺苷的生成[7-8]。右美托咪定的镇痛作用主要是作用于脊髓后角突触前和中间神经元突触后膜α2肾上腺素能受体，使细胞膜超极化[9-10]，抑制疼痛信号向脑的传导。

一些经典的NF-κB 激活因子，如tumor necrosis factor α（TNFα） 、interleukin 1 （IL-1）、lipopolysaccharide （LPS），然而还存在一些非经典的激活因子，如UV-C 和一些化疗药物。经典的激活因子激活NF-κB 非常迅速，1 h 可达高峰，而非经典的激活因子激活NF-κB 则相对较慢。已发现[11]多种可被NF-κB上调的抗凋亡基因，如Bcl-xL、 X-IAP、IAP1、 IAP2、IEX-1L、Bfl-1。

本研究中发现α2-肾上腺受体激动剂右美托咪定可以增强Nf-κB 基因的表达水平，在转录水平上我们通过reporter assay 实验和rt-pcr 实验证实Nf-κB 基因的表达与右美托咪定的药物剂量密切相关，在一定范围内随着药物浓度的升高基因表达增强。同时我们在蛋白水平上也证实了Nf-κB 的抑制因子ikbα 随着药物浓度的升高降解加速，这也直接证实了药物浓度升高激活了Nf-κB 和入核，从而进一步激活下游靶分子的表达和影响免疫分子和炎症因子的水平。当然我们还可以深入研究动物模型中的分子机制，为指导临床合理选择药物打下坚实的理论基础。