人体血清中3种脂溶性维生素的液相色谱-串联质谱分析方法研究

刘海培,姜小梅,韩文念，许舒欣，李 艳，汪 曣，蒋学慧*

(1.天津大学 精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；2.天津国科医工科技发展有限公司，天津 300399)

维生素是维持人体健康所必需的物质，其缺乏或过量均会影响人体代谢平衡。其中，维生素A(VA)、维生素D3(VD3)、维生素E(VE)为脂溶性维生素，具有促进机体生长发育，调节生理机能，增强免疫的作用[1]，可在体内大量贮存，属于人体内源性代谢物。通过检测维生素的含量可评估患者体内的营养状况，目前的测定方法主要有酶免疫法[2]、化学发光免疫法[3]及质谱法等。其中，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[4-5]具有高精确度、高灵敏度和可实时监测的优势，对于维生素缺乏的临床判断、治疗管理具有辅助诊断的作用[6-7]。

液相色谱-质谱联用技术用于内源性代谢物的实际分析时，真实的生物基质(Authentic matrix)中含有的待测物质会影响标准样品浓度，从而影响定量结果的准确性[8-9]。目前常采用牛血清白蛋白(BSA)等替代基质(Surrogate matrix)[10-11]来模拟生物基质，或采用活性炭吸附等前处理手段从真实生物基质中得到已去除内源性代谢物的剥离基质(Stripped matrix)[12]。然而此方法成本高，且可能破坏除内源性代谢物以外的基质成分或者内源性代谢物去除不完全，影响样本原有信息，从而导致基质效应问题[13-14]。另外一些新开发的方法无法找到合适的空白基质，给定量分析增加了难度。

本研究利用LC-MS/MS对人体血清中维生素A、维生素D3和维生素E 3种脂溶性维生素进行同时检测，以混合人血清基质中加入标准品并结合同位素内标法建立标准曲线进行定量，通过对内源性代谢物本底扣除的方法，解决了模拟基质下检测的标准品与待测基质不匹配的问题，并与BSA模拟基质方法的检测结果进行对比。所建立的方法适用于人体内源性代谢物的快速准确分析，可满足临床对于相关疾病的诊断需求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AX液相色谱仪(岛津公司)，API4000三重四极杆质谱仪(AB SCIEX公司)，F138469O离心机(Eppendorf公司)，VORTEX-5旋涡混合器(其林贝尔仪器公司)，96孔氮吹仪(VSD150-1A,无锡沃信仪器制造有限公司)，微量移液器(N32901F、N46632F、P24390G、O47528F,Eppendorf公司)，离心管(3810X,Eppendorf公司)。

甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，Fisher Chemical公司)；正己烷(色谱纯,Sigma-Aldrich公司)；牛血清白蛋白(Amresco公司)，蒸馏水(屈臣氏集团有限公司)。

维生素A(100 mg/L)、25-羟基维生素D3干粉试剂以及维生素E(1 000 mg/L)标准品均购于加拿大多伦多研究化学公司，维生素A乙酸酯(VA-D6)、25-羟基维生素D3-D6干粉试剂(VD3-D6)、α-生育酚D6(VE-D6,500 mg/L)内标标准品均购于Medical Isotopes公司。

1.2 实验条件

色谱条件：色谱柱为Shim-pack GIST-HP C18(2.1 mm×100 mm×3 μm，岛津公司)，流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱程序：0～2.0 min，70% B；2.0～5.0 min，70% ～100% B；5.0～5.1 min，100% B；5.1～6.5 min，100%～70%B。流速为0.5 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为10 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)扫描模式，气帘气(CUR)压力 103 kPa，离子化电压(IS) 5 500 V，温度(TEM)设为350 ℃，喷雾气(GS1)压力 414 kPa，辅助加热气(GS2)压力 448 kPa。3种脂溶性维生素的质谱参数见表1，选取Q1质量数为母离子，Q3质量数为子离子进行定量分析。

表1 3种脂溶性维生素的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of three fat-soluble vitamins

*DP:declustering potential;CE:collision energy;CXP:collision cell exit potential;EP:entrance potential

1.3 样品配制

1.3.1 空白样品制备取90 μL混合人血清，加入10 μL甲醇和10 μL内标工作液得到空白基质样品，取牛血清白蛋白(5% BSA)按相同步骤得到空白基质样品，作为对照。

1.3.2 标准样品制备称取标准样品，采用甲醇逐级稀释得到标准工作溶液。分别精密吸取90 μL混合人血清和5% BSA，各加入标准工作溶液10 μL，配制各浓度的生物标准曲线样品，加入10 μL内标工作液以及200 μL甲醇-乙腈(体积比1∶1)作为沉淀剂，涡旋振荡60 s；再加入600 μL正己烷作为萃取剂，剧烈振荡120 s；以14 000 g转速离心5 min，取上层有机层500 μL，室温下氮气吹干，加入50%甲醇水溶液100 μL进行复溶，充分混匀30 s后，待LC-MS/MS分析。

1.4 数据处理方法

分别采用混合人血清基质和BSA基质配制已知浓度的标准样品与未知浓度的待测样品，在相同实验条件下依次进行LC-MS/MS检测，得到每组样品的信号色谱峰及其对应的内标峰面积。其中，混合人血清基质作为空白基质样品，平行进样8组，确定空白背景的稳定性。计算得到混合人血清空白基质样品的色谱峰与其对应内标的峰面积比值，在混合人血清基质下得到的标准样品色谱峰与其对应内标峰面积的比值减去空白样品比值的平均值，即通过本底扣除的方法去除人体内源性代谢物引入的干扰。所得结果与传统BSA模拟基质样品的测定结果进行对比，采用同位素内标法分别建立标准曲线，对定量分析结果进行比较。

1.5 方法评价

1.5.1 线性范围与检出限将配制的生物标准曲线样品经前处理后进样分析，以目标分析物的质量浓度为横坐标(X)，其峰面积与对应内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，建立标准曲线[15]；以3倍信噪比(S/N=3)，且3次测定的相对标准偏差(RSD)小于20%作为各成分的检出限(LOD)，以S/N=10且RSD小于20%作为各成分的定量下限(LOQ)。

1.5.2 准确度与精密度通过比较混合人血清基质和BSA基质样品的加标回收率，确定实验方法的准确性。对待测人血清样品加入低、高两个浓度的3种脂溶性维生素标准品，分别带入混合人血清基质和BSA基质下建立的标准曲线，计算样品回收率；每天对加标样品测定1次，连续检测5 d，通过计算RSD值验证两种方法的重现性。

此外，对于混合人血清空白基质样品做8组平行样，每个平行样重复进样2次求得平均值，批间实验每组采用不同混合人血清，以去除人员个体间差异的影响，连续检测5 d。通过计算RSD值确保混合人血清空白基质样品批内、批间的稳定性。

1.5.3 方法对比对于40组未知浓度样本，通过采用混合人血清基质和BSA模拟基质的方法分别进行LC-MS/MS检测，利用两种方法建立的标准曲线分别计算得到3种待测维生素的浓度，并进行对比和统计学分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

考察了有机相溶剂(甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合溶剂)分别与超纯水、0.1%甲酸、0.1%氨水组成的流动相体系对于3种脂溶性维生素峰形及分离效果的影响，结果表明，以甲醇和超纯水为流动相体系，并在两相中分别加入0.1%甲酸，可增加分析物的响应强度，且峰形良好。根据3种脂溶性维生素的疏水特性，选择C18柱，考察了色谱柱温度(30、35、40、45 ℃)对分离效果和信号强度的影响，最终采用“1.2”的梯度洗脱方式，在40 ℃柱温下可得到较好的分离效果。

根据目标分析物的电离情况，选用正离子监测模式进行一级质谱分析，确定母离子后再进行二级质谱的子离子扫描分析，选择强度较高的1个碎片离子作为定量分析的子离子，并对去簇电压(DP)、碰撞能(CE)以及碰撞室出口电压(CXP)等参数进行优化。最终确定优化的质谱条件如“1.2”所示，此时检测信号响应强度高，谱峰峰形良好且稳定。

在优化实验条件下，得到3种脂溶性维生素在混合人血清基质下的谱峰及其内标峰的色谱图(见图1)，其中维生素A、维生素D3、维生素E及对应内标的保留时间分别为3.45、3.33、4.65 min，可在5 min内完成分离检测，谱峰峰形良好。

2.2 本底稳定性

按照“1.5.2”方法对混合人血清空白基质样品进行日内、日间精密度的测试，对待测维生素的峰面积及其内标的峰面积进行提取，计算两者的比值，每天做8组平行样品，得到3种脂溶性维生素的日内RSD均不大于8.4%；每天采用不同20份混合人血清空白基质进行测定，连续检测5 d，得到3种脂溶性维生素的日间RSD均在15% 以内，表明混合人血清空白基质样品稳定，可对混合人血清基质的实际样品本底进行背景扣除。

2.3 线性范围、检出限及定量下限

按照“1.5.1”进行曲线拟合，结果显示，采用混合人血清经背景扣除后建立的标准曲线与BSA基质建立的标准曲线，对于3种脂溶性维生素的相关系数(r)均在0.996以上，维生素A、维生素D3和维生素E分别在0.05～2 μg/mL、5～200 ng/mL、1～40 μg/mL范围内具有良好线性。采用混合人血清基质所建方法对维生素A、维生素D3和维生素E的LOD分别为4.2、0.8、67.2 ng/mL，LOQ分别为13.7、2.6、221.9 ng/mL；采用BSA基质所建方法对维生素A、维生素D3和维生素E的LOD分别为5.6、1.1、75.0 ng/mL，LOQ分别为18.7、3.7、250.0 ng/mL。两种方法对3种脂溶性维生素的标准曲线对比见图2，结果显示，两种方法的拟合效果显著接近。

图2 维生素A(A)、维生素D3(B)、维生素E(C)的标准曲线对比Fig.2 Comparison of standard curve of vitamin A(A),vitamin D3(B) and vitamin E(C)BSA matrix;mixed human serum matrix

2.4 加标回收实验

按照“1.5.2”方法对待测人血清样品进行加标回收实验，每个浓度水平重复5次，两种方法计算得到维生素A、维生素D3和维生素E的回收率为90.7%～112%，RSD均为1.0%～4.5%(见表2)，表明两种方法均具有较好的准确度和精密度。连续5 d对低、高两个浓度的加标样品进行测定，两种方法下3种脂溶性维生素在低浓度水平的加标回收率偏差均在±20%以内，高浓度水平的加标回收率偏差在±15%以内，满足方法学评定要求。

表2 维生素A、维生素D3和维生素E的加标回收率及相对标准偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of vitamin A,vitamin D3 and vitamin E

2.5 方法学比较

对40份健康志愿者的血清样本进行LC-MS/MS测定，分别采用混合人血清空白基质加标和BSA空白基质加标的方法建立标准曲线，样本年龄在29～86岁，其中16名男性，24名女性。对两种方法的测定结果进行比较，如图3所示，经过T检验分析，维生素A、维生素D3和维生素E的P值分别为0.92、0.78、0.93(均大于0.7)，说明两种方法的计算结果无显著差异。结果表明，40份健康志愿者血清中维生素A、维生素D3和维生素E的质量浓度分别为280～1 000 ng/mL、5～28 ng/mL、5～28 μg/mL，且采用混合人血清基质对实际样品中3种脂溶性维生素的检测结果与BSA模拟基质的检测结果基本重合，进一步验证了本方法的可行性。

图3 两种方法检测浓度对比Fig.3 Detecting concentration comparison of two methods mixed human serum matrix;BSA matrix

3 结 论

本研究以人体血清中3种脂溶性维生素检测为例，探讨了一种分析人体内源性代谢物的新方法，采用以混合人血清作为空白基质加入标准品及同位素内标物再对内源性物质扣除本底的方法，可以实现标准曲线样品与实际待测样品基质匹配，减少基质效应的干扰且更加便捷。通过实验证明，此方法与采用BSA模拟基质加入标准品及同位素内标物检测的方法均满足方法学评定标准，具有良好的准确性与重现性。因此，针对某些内源性化合物无法获得纯净空白基质，以及由于模拟基质下检测的标准品与待测样品基质不匹配引起的基质效应问题，可以采用直接混合人血清扣除本底的方法，实现对人体内源性代谢物的定量分析。研究结果对于临床分析检测具有重要意义。