基于MnO2/石墨烯纳米材料的表面辅助激光解吸电离质谱在内毒素快速鉴定中的应用

欧阳丹，吴 杰，谢更奇，郑梓扬，施涵强，陈 锋，陈玉谊，林子俺

(1.福州大学 化学学院食品安全与生物分析教育部重点实验室,福建 福州 350116；2.莆田市食品药品检验检测中心,福建 莆田 351100)

内毒素(Endotoxin)为一种外源性的致热源，是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有结构，其主要成分是亲水性的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)[1-4].内毒素广泛存在于水体、土壤等与人体密切相关的环境中，并且人体对内毒素的免疫反应非常敏感，极微量的内毒素就可引起人体温升高等各种不良反应.因此，建立一种快速筛查鉴别内毒素的方法，加强对各类药物、食品、饮料、水源及生物制品中的内毒素检测，严格控制其含量，对于保障人民的身体健康及社会卫生的公共安全具有重要的意义.

目前，《中国药典》上所记载的细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法[5].两种方法均是通过鲎试剂与细菌内毒素产生反应的原理来进行检测.鲎试剂方法是内毒素检测的金标准，是当前最灵敏的细菌内毒素检测方法[6].尽管如此，此法仍存在着反应条件苛刻、影响因素众多、鲎源不易获取等缺点.近年来，基于光谱技术的内毒素检测方法逐渐发展，并克服了传统内毒素检测方法的缺点，但依然存在耗样量大、定性定量难以兼顾等缺点，尤其是无法对复杂样品中内毒素进行有效提取或富集.因此发展一种高灵敏、高通量、简便、快速的内毒素检测方法势在必行.

基质辅助激光解吸电离质谱(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry ,MALDI-MS)是一种新型高效的软电离有机质谱，近年来已成为分析生物大分子不可或缺的工具之一[7-10].但其最大的局限性在于传统基质与样品共结晶时存在不均匀现象(甜点效应)，严重影响试验的重现性，因此难以进行定量分析.而基于纳米基质的表面辅助激光解吸电离质谱(SALDI-MS)则可以有效地减少基质的“甜点效应”，较好的解决了重现性的问题.另外，SALDI-MS 还具有许多其它优点，如样品制备简单、信噪比高、耐盐性好、基底表面信号重复性好以及可实现样品的定量分析等，显示出了较好的应用前景[11-14].本文采用溶剂热法合成了一种MnO2/石墨烯(MnO2/G)纳米复合材料，以大肠埃希菌中提取精致的内毒素(Control standard endotoxin，CSE)为分析对象，建立了一种基于MnO2/G纳米材料的SALDI-MS的内毒素检测新方法，并成功实现了对各种注射液及饮用水中内毒素的快速鉴定和定量分析.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM，型号：Tecnai G2 20，美国)；紫外可见分光光度计(Ultraviolet-visible spectrometer，UV-Vis，型号：UV-9000S，上海)；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/MS，型号：Bruker Autoflex speed Ⅱ,Bruker Daltonics Inc.，美国)

盐酸林可霉素注射液、柴胡注射液、氯霉素注射液、普鲁卡英肾上腺素注射液和灭菌注射用水等样品均由福建省莆田市食品药品检验检测中心提供；品牌饮用水样品购自当地超市；石墨烯、乙醇、乙酸锰购于上海麦克林生化科技有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)由Bruker公司提供；细菌内毒素工作标准品及细菌内毒素检查用水购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司.

1.2 MnO2/G纳米复合材料的制备

称取50 mg石墨烯，将其分散于100 mL乙醇中，超声1 h，得到稳定的石墨烯悬浊液.向该悬浊液中加入0.1 mol乙酸锰,磁力搅拌1 h后，于90 ℃水浴锅中加热1 h，转移至400 ℃退火3 h,制备得到MnO2/G纳米材料[15].

1.3 细菌内毒素工作标准品溶液的制备

溶解：取一支细菌内毒素标准品(10 EU)，加入1 mL的细菌内毒素检查用水，复溶后置于漩涡混匀器上混匀15 min，得到浓度为10 EU/mL的内毒素溶液.

稀释：根据试验需要逐步稀释,制备浓度分别为1、0.5、0.2、0.1 EU/mL的细菌内毒素标准品溶液.

1.4 MALDI-MS与SALDI-MS样品制备

称取30 mg CHCA基质，加入1 mL的乙腈/水(体积比为3:7)溶剂，配制成质量浓度为 30 mg/mL的CHCA溶液.将MnO2/G纳米复合材料分散于乙醇/水(体积比为1∶1)中并超声1 min，形成均匀的悬浮液(2 mg/mL).将基质溶液/待分析物(体积比为1∶1)混匀后，移取1 μL，点在靶板上，自然干燥.

1.5 质谱分析

将样品靶板放入质谱仪器，仪器参数调整为线性正离子模式，离子源电压为19 kV，延迟提取120 ns，激光照射设置为300次.连续采集谱图，采用flexAnalysis(Bruker Daltonics Inc.，美国)软件处理数据.

2 结果与讨论

2.1 MnO2/G纳米复合材料的表征

参考文献 [15]，本文采用溶剂热法制备MnO2/G纳米复合材料，其结构如图1所示.从图1(a)可知，MnO2/G纳米复合材料具有典型的纳米片层状结构，与石墨烯相似.该复合材料分散性较好、比表面积大，有助于激光能量的吸收与转移.X射线能谱分析(EDS)显示该复合材料含有Mn、O和C元素(Cu为铜网自身所含元素)，表明MnO2/G纳米复合材料已成功制备(图1(b)).图1(c)为0.05 mg/mL MnO2/G水溶液的紫外可见吸收光谱图.由图1(c)可知，在波长300～400 nm区间，该材料表现出较强的紫外光吸收能力，且与MALDI激光光源(λ=337 nm)相匹配，表明其具有作为SALDI基质的潜力.由图1 (d)可见，样品与MnO2/G纳米基质共混结晶均匀，“甜点效应”小，有利于实现定量分析和提高试验的重现性.

图1 MnO2/G纳米复合材料的(a)透射电镜图,(b)X射线能谱分析,(c)紫外可见吸收光谱图(内插图为0.05 mg/mL的MnO2/G水溶液),(d)样品/基质共混结晶分布光学图Fig.1 Characterization of MnO2/G nanocomposites (a)TEM,(b)EDS spectrum,(c)UV-vis spectrum and (d)optical image of sample/matrix co-crystallization

2.2 基于MALDI-MS和SALDI-MS的内毒素鉴定

以1 EU/mL的内毒素溶液为考察对象，使用有机基质(CHCA)和本文所开发的MnO2/G纳米复合材料为基质，分别采用传统的MALDI-MS 和SALDI-MS方法对其检测，试验结果如图2所示.由图2可见，当以CHCA为基质时，在m/z 7 000左右出现内毒素的特征峰，而以MnO2/G纳米复合材料为基质时，同样在m/z 7 000左右出现内毒素的特征峰.与前者相比，采用MnO2/G纳米基质可以获得更强的质谱信号，其原因可能在于MnO2/G纳米复合材料具有高的表面积和更强的电子解吸/转移能力，有助于内毒素的高效电离，进而获得更高的质谱响应[12].

图2 (a)基于MALDI-MS的内毒素鉴定,(b)基于SALDI-MS的内毒素鉴定(浓度为1 EU/mL)Fig.2 Determination of CSE (1 EU/mL)by biomass spectrometry for (a)MALDI-MS using CHCA as matrix,(b)SALDI-MS using MnO2/G as matrix

2.3 基于SALDI-MS的内毒素定量分析及重现性考察

以MnO2/G纳米复合材料为基质的SALDI-MS,使得CSE的定量分析成为可能.配制一系列不同浓度的CSE标准溶液，在最优化的SLDI-MS条件下测试，结果如图3(a)所示.由图3(a)可见，随着CSE浓度的下降，其质谱信号强度逐渐下降，表明其浓度与质谱信号强度呈现一定的比例关系.在最优质谱参数下，CSE在0.1 ～1 EU/mL范围内呈现良好的线性，回归方程为y=127.103 35x+8.908 91，R2=0.998 69(图3(b))，以基线噪声 (S/N)3倍值对应CSE的浓度,检测限为 0.05 EU/mL.此外，试验还考察了SALDI-MS方法的重现性，结果如图3(c)所示.通过连续分析10个内毒素的不同样品点(浓度为0.5 EU/mL)，可获得内毒素质谱信号强度，其RSD为9.02% (n=10)，表明该方法具有较好的重现性.

图3 基于SALDI-MS的内毒素定量分析(a)不同浓度的内毒素,(b)内毒素标准工作曲线,(c)重现性考察Fig.3 SALDI-MS for CSE analysis (a)dierent concentrations of CSE,(b)calibration curve of CSE and (c)reproducibility

2.4 基于SALDI-MS的注射液及饮用水样品分析

为了验证方法的可行性，本文以MnO2/G纳米复合材料为基质，采用SALDI-MS方法对注射液及饮用水中的内毒素进行鉴定及定量分析.依据内毒素标准品溶液浓度与质谱信号强度间的线性关系，计算所得样品中内毒素的实际含量，并与传统的鲎试剂方法所得结果进行比较，结果如表1所列.由表1可见，SALDI-MS方法测得样品中的内毒素浓度与传统的鲎试剂方法结果吻合.经统计学检验(配对t检验)，计算所得结果显示P>0.05，两种方法测得结果无显著差异.但与传统鲎试剂方法相比，SALDI-MS方法具有操作简便、检测速度快(<5 min)、无需复杂的样品前处理、通量高和耐盐性好等诸多优点，表明该方法具有良好的实际应用价值.

表1 SALDI-MS法与鲎试剂法检测注射液和饮用水中的内毒素Table 1 Results of endotoxin concentrations measured by SALDI-MS and TAL

3 结论

本文采用溶剂热法制备了MnO2/G纳米复合材料，并建立了一种基于MnO2/G纳米复合材料的SALDI-MS的内毒素快速检测方法.与传统的内毒素检测方法相比，本文所建立的SALDI-MS方法具有操作简便、灵敏度高、分辨率高、检测速度快、高通量、耐盐性好等优点.将该方法应用于注射液及饮用水中内毒素的快速鉴定与定量分析，取得了令人满意的结果.该方法有望进一步应用于其他类食品药品中内毒素的快速筛查与鉴定.