荧光定量PCR测定HBV DNA测量不确定度的评定与应用探讨*

李育敏，徐 怡，阚丽娟，张水兰，汤花梅，许晓清，熊 丹，张秀明

(深圳市罗湖区人民医院医学检验科，广东深圳 518001)

测量不确定度(简称不确定度)，是指表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数[1]。荧光定量PCR检测HBV DNA的不确定度评定、报告及应用是近年来医学实验室关注的问题。首先，评定不确定度是改进医学实验室质量的有效途径。而目前国际上发布的《测量不确定度评定指南》(guide to the expression of uncertainty in measurement，GUM)[2]和《测量不确定度的量化》(quantifying uncertainty in analytical measurement，QUAM)[3]等文件如直接用于临床基因扩增检验尚缺乏实用性。其次，ISO/IEC 17025《检测和校准实验室能力的通用要求》[4]，ISO 15189《医学实验室质量和能力的专用要求》[5]、美国临床实验室标准化研究所(CLSI)C51-P指南[6]以及中国合格评定国家认可委员会(CNAS)最新发布的CNAS-CL01-G003《测量不确定度的要求》[7]除了对不确定度评定提出要求外，还强调实验室应该提供检测结果的不确定度，在适用时检测报告中应报告结果的不确定度。第三，荧光定量PCR灵敏度高，同一实验室以及不同实验室间结果可比性保证存在一定局限性，建立量值溯源性可使检测结果达到一致性。第四，国内学者[8-10]先后对荧光定量PCR测定HBV DNA的不确定度进行了评定以及介绍不确定度报告及应用，但在评定方法及临床应用上仍需进一步探讨。本研究参考文献[8-10]及CNAS技术报告CNAS-TRL-001《医学实验室-测量不确定度的评定与表达》[11]对本实验室荧光定量PCR测定HBV DNA的不确定度进行评定，并对不同评定方法进行比较，以及对不确定度报告的临床应用进行探讨。

1材料与方法

1.1 材料 批内重复性实验取2例HBV DNA浓度分别在103IU/ml和106IU/ml水平的患者血清(其不确定度评估浓度参照高、低2个室内质控物水平选择)。批间重复性实验采用室内质控物(北京康彻思坦)，高水平为4.60E+06 IU/ml(批号201609003)，低水平为1.41E+03 IU/ml(批号201607003)，按照厂家说明书分装保存于-15℃以下。

1.2 试剂与仪器 试剂为湖南圣湘生物科技有限公司的HBV DNA荧光定量PCR试剂盒，线性范围为1.0E+02～5.0E+09 IU/ml。仪器为罗氏cobas○Rz480荧光定量PCR分析仪。操作按照试剂盒和仪器说明书进行。

1.3 测量不确定度的评定

1.3.4 扩展不确定度(U)的评定[8-9]：U=Uc×k，k为包含因子，对于正态分布，取P=95%置信区间，k=1.96。

1.4 测量不确定度报告 以测量观测值n=2为例，报告为：HBV DNA测定结果：X±UIU/ml(k=1.96，n=2)，X为测量结果的对数值。适用检测范围为1.0E+02～5.0E+09 IU/ml。测量量值与临床决定限进行诊断性比较时，取k=1.96，两者差值△符合|△|≥1.96Uc或|△|≥U，差异具有统计学意义。

2结果

2.1 各分量结果 荧光定量PCR测定HBV DNA不确定度各分量数据见表1。批内和批间重复性引入的不确定度分量随测量观测值数量的增加而减小；批内重复性引入的不确定度[U(w)]所占比重最低。采用EQA同方法组均值评定偏移引入的不确定度[U(bias)]，以偏移与偏移的标准差评定U1(bias)较以方法和实验室偏移评定U2(bias)低。

表1 荧光定量PCR测定HBV DNA测量不确定度的各分量数据

注：U(w)，批内重复性不确定度；U(b)，批间重复性不确定度；U1(bias)，以偏移与偏移的标准差评定偏移不确定度；U2(bias)，以方法和实验室偏移评定偏移不确定度；n，测量观测值个数；靶值，表示用EQA靶值评定U(bias)；同方法组均值，表示用EQA同方法组均值评定U(bias)。

2.2Uc和U随测量观测值数量的增加而减小 见表2、表3。

表2 采用EQA靶值评定荧光定量PCR测定HBV DNA的Uc和U(k=l.96)

在检测范围内，同一测量观测值条件下，低浓度水平处的Uc和U较高浓度高。采用EQA靶值评定U(bias)，取n=1，在低浓度水平处以偏移与偏移的标准差评定的偏移不确定度[U1(bias)]计算Uc1和Uc2分别为0.215 2和0.197 0，与以方法和实验室偏移评定的[U2(bias)]计算Uc1和Uc2(0.215 1和0.196 9)相近；同样采用同方法组均值评定U(bias)，以U1(bias)评定Uc和U与以U2(bias)评定结果相近。同一U(bias)条件下，采用EQA靶值和同方法组均值评定Uc和U结果相近。

表3 采用EQA同方法组均值评定荧光定量PCR测定HBV DNA的Uc和U(k=l.96)

2.3 测量不确定度报告 取k=1.96，n=2，如样本的检测结果为1.0E+02 IU/ml(2.0 IU/ml，LOG值)，其测量量值为2.0±0.330 2 IU/ml，即1.67～2.33 IU/ml，与临床决定限(检测下限2.0 IU/ml，LOG值)进行比较，检测结果达到临床决定限，但其测量量值减去扩展不确定度后低于临床决定限，因此无法确定其结果是否为临床决定限水平。如样本的测量量值为3.0E+02 IU/ml(2.48 IU/ml，LOG值)，取k=1.96，则测量量值为2.15～2.81 IU/ml，高于临床决定限水平。

2.4 两个测量量值比较 取k=1.96，n=2，如患者治疗前后的两次量值均在本实验室测量，取U为0.330 2，则两次测量量值差值△≥0.46(1.4×0.330 2)IU/ml，差异具有统计学意义。

3讨论国内外学者均提出自上而下评定常规医学实验室不确定度是可接受和实用的方法[6，11-12，14-17]。本研究利用该方法评定HBV DNA测定的不确定度，首先进行A类评定，即采用批内和批间重复性评定不精密度/实验室内复现性分量引入的不确定度，其U(w)和U(b)均较已报道低[8-9]，表明本实验室的不精密度小，与其他实验室相比性能数据可接受。多数学者[16，18]认为生化检验只需评定批间精密度，因为常规标本一般不进行重复测量，批内精密度不能反映实际检测情况，因此只采用IQC数据来评定批间不精密度的不确定度。本研究也表明批内重复性引入的U(w)所占比重最低，通过批内加批间重复性和偏移评定HBV DNA的不确定度与批间重复性加偏移评定结果相近。

应用EQA数据评定正确度/偏移引入的不确定度是医学实验室常用的方法。本研究通过B类评定，表明U(bias)在不确定度中所占比重较U(b)低，与蒋玲丽[9]等报道相符合，而沈伟锋等[8]在早期报道中U(bias)较高，可能与近年来参加EQA HBV DNA项目的实验室数量增多以及测定水平提高导致U(bias)较小有关。目前文献[8-9]报道HBV DNA测定的偏移不确定度评定是参考王治国等[12]以偏移和偏移的标准差评定U(bias)，而生化检验的不确定度评定多采用Nordest[13]以方法和实验室偏移评定U(bias)。本研究数据表明利用EQA靶值，以上两种方法评定的U(bias)无明显差异；利用同方法组均值，U(bias)有一定差异，但取n=1，Uc1和Uc2与EQA靶值评定的结果接近，说明以上两种方法均可用于评定HBV DNA测定的偏移不确定度。蒋玲丽等[9]采用卫健委临检中心和CAP的EQA数据进行偏移不确定度评定时，两者差异较大，分析原因为卫健委临检中心采用溯源至国家标准品得出的检测值作为靶值，而CAP以方法组均值作为靶值，因此提出采用EQA数据评定不能反映实验室的真实不确定度。沈伟锋等[10]采用国家标准物质评定不同实验室的HBV DNA测量不确定度，提出其评定的不确定度报告使检测结果具有可比性。由于EQA样本经过加工，与临床样本存在差异，结合本研究数据和文献[8-10]，建议测定国家标准物质来评定HBV DNA测量不确定度，如采用EQA数据，以同方法组均值计算U(bias)。

目前临床治疗乙肝以乙肝表面抗原定量结果和HBV DNA定量结果作为评价患者体内病毒复制水平和临床抗病毒疗效判断的金标准，但是通常根据经验认为HBV DNA水平降低或升高1～2个数量级为有意义。有学者[8，10]提出将不确定度随测定结果报告给临床可使结果比较科学量化，避免以往的盲目判断标准。本研究表明如患者治疗前后的两次结果均在本实验室测量，差值≥0.46，具有统计学意义，为临床进行治疗前后的结果比较提供了依据，有助于判断患者体内病毒复制水平和抗病毒疗效。

综上所述，本研究对CNAS及文献的不确定度不同评定方法进行了比较，并提出本实验室评定的HBV DNA不确定度报告在患者治疗前后疗效判断的临床意义，为荧光定量PCR测定HBV DNA不确定度的评定和应用提供了一定的参考依据，但是采用EQA数据还是国家标准物质测定数据对评定和应用更具有价值还有待更多的研究。临床实验室是近年来才开始引入测量不确定度的概念，业内一直存在关于评定不确定度和总误差的争论[19-20]，未来不确定度能否取代总误差也需进一步探讨。