日本积水公司血浆全程C-反应蛋白胶乳免疫比浊法最低检测限和功能灵敏度的确认*

谢正媛，陈涓涓，祖维磊，李奕晓，李 欣，孙 虹

(云南省人口和计划生育科学技术研究所西部孕前优生重点实验室 云南省生育调节与少数民族优生重点实验室，昆明 650021)

C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是一种由肝脏合成的蛋白质，因能与肺炎球菌细胞壁C多糖结合而得名，是目前最有价值的急性时相反应蛋白，被广泛应用于感染性疾病[1]、各类心血管疾病的诊断及监测[2-3]。使用检测低限≤0.3 mg/L方法检测到的CRP即为超敏C-反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)，其水平与动脉粥样硬化及急性脑梗死(ACI) 的发生、严重程度及预后密切相关[4]。有文献报道我国健康人群hs-CRP的中位数为0.58～1.13 mg/L，hs-CRP浓度≥3.0 mg/L可作为心血管疾病风险发生的潜在标志物[5]。鉴于hs-CRP在心血管疾病风险评估中的重要价值，实验室进行hs-CRP检测时需评估检测低限是否满足hs-CRP的要求，本研究参照相关文献[6-7]对日本积水医疗株式会社全程CRP试剂最低检测限(lowlimit of detection，LLD)和功能灵敏度(funtional sensitivity，FS)进行了确认，现将相关研究结果进行报道。

1材料与方法

1.1 实验样本

1.1.1 空白样本：根据试剂盒要求用生理盐水为空白样本。

1.1.2 低浓度系列检测样本：因试剂盒提供的最低检测限为0.1 mg/L，以生理盐水为稀释液，将厂家提供的3.0 mg/L浓度标准液稀释成理论浓度为0.10，0.30，0.60，1.20，2.40和3.00 mg/L的低浓度系列样本备用。

1.2 试剂和仪器 日本积水医疗株式会社全程CRP检测试剂盒，CRM470校准品(国际有证参考材料)，6点校准品(3.0，6.0，30.0，180.0，300.0，420.0 mg/L)，美国雅培公司CI-16200全自动生化分析免疫一体机。

1.3 方法 胶乳免疫比浊法。

1.3.1 取空白样本1份批内重复测定10次，记录每次测定结果的吸光度A(仪器定期进行校准，检测前做室内质控在控)。

1.3.2 标准曲线：取空白样本和6个浓度校准品进行双份测定，记录每次测定结果的吸光度A均值。

1.3.3 取低浓度系列样本每天测定1次，连续测定10天，记录每天测定结果的吸光度A。

1.4 统计学分析 所有数据均采用Excel 2010统计软件进行。

1.4.2 绘制低浓度系列标准曲线：将S0～S6系列样本的吸光度A与相应的理论浓度制成低浓度系列标准曲线备用。

1.4.3 绘制低浓度系列样本CV%与理论浓度的曲线图：以低浓度系列样本的CV%为Y轴、理论浓度为X轴制图。在图上找到CV%最接近20%的点，该点对应的分析物浓度即为CRP试剂的功能灵敏度[6-7]。

表1 空白样本和系列低浓度样本CRP检测结果的吸光度A

2结果

2.1 空白样本与6个低浓度系列样本10次检测结果的吸光度A见表1。由表1可见随着样本浓度的升高，检测结果吸光度的CV%逐渐下降。

2.2 全程CRP试剂盒的LLD 99.7%可能性估计的LLD=A空白+3s空白=0.000 9+3×0.000 3=0.001 8A，既检测低限的吸光度为0.001 8A，为检测系统的噪声。由表1可见0.001 8A相当于样本S1和S2(0.1～0.3 mg/L)之间所产生的吸光度，在系列低浓度的标准曲线上查阅吸光度值0.001 8A对应的CRP理论浓度为0.21 mg/L，既全程CRP检测方法在本实验室的最低检测限为0.21 mg/L。

2.3 全程CRP试剂盒的功能灵敏度 查CRP理论浓度与吸光度CV%关系图(图1)可见，CV%为20%对应的CRP理论浓度是0.27 mg/L，既全程CRP检测方法在本实验室的FS为0.27 mg/L。

图1 CRP理论浓度与吸光度CV%关系图

3讨论最低检测限指能检测到的样本中分析物最小量，是基于零浓度基础上检测方法对空白样本测定的噪音，用于区分从无到有的分析能力，临床多用于测定人体内不存在的分析物。功能灵敏度指在实际检测中能够测到的待测物最低浓度值，以天间重复CV%为20%对应的检测限样本平均浓度代表某个定量检测可报告低限。这个值一般要比最低检测限高，用于区分从有到无的分析能力，临床上用于测定人体内存在的极微量分析物。hs-CRP的定量检测限是可以为临床提供可靠定量数据的重要限值，但本实验室使用的检测方法仅提供线性范围0.1～420 mg/L，未提供检测低限，经确认最低检测限和功能灵敏度都能满足检测低限≤0.3 mg/L的要求。

随着检测技术的发展，实验室将会更多的采用高敏或超敏方法来检测具有较高临床价值的低含量物质，除hs-CRP外目前常用的还有高敏心肌肌钙蛋白和B型利钠肽原等，其相关的国际或国内指南如心力衰竭标志物指南[8]和高敏心肌肌钙蛋白在急性冠脉综合征中的应用中国专家共识[9]都对其测定方法的不精密度和检测低限提出要求。实验室在使用这些方法时，应按照行业相关要求对其检测低限和功能灵敏度进行确认，以明确其性能是否满足要求，才能让检验结果更好地服务于临床。