19A-ST320肺炎链球菌引起儿童急性中耳炎的实验室及临床特征分析*

雷 磊，李 倩，贾 虎

(延安大学附属医院 a.耳科；b.超声科，陕西延安 716000)

急性中耳炎(acute otitis media，AOM)是中耳黏膜的急性化脓性炎症，好发于婴幼儿，治疗不及时可导致患者鼓膜穿孔引起患耳流脓及听力下降。肺炎链球菌是AOM最常见的致病菌之一，19A-ST320肺炎链球菌是目前最常见的血清及序列分型，在未接种7价肺炎球菌疫苗(pneumococcal 7-valent conjugate vaccine，PCV7)的人群中，该类型所占比例更高[1-3]。既往研究表明19A-ST320肺炎链球菌具有高毒性和较强的抗生素抗性，即使使用高剂量的β-内酰胺抗生素进行治疗，19A-ST320肺炎链球菌引起的儿童AOM相关症状持续时间也较长[4-5]。本研究旨在探究19A-ST320肺炎链球菌引起的儿童AOM的临床特征及抗菌治疗效果。

1材料与方法

1.1 研究对象 收集2013年12月～2016年11月期间于延安大学附属医院住院治疗的AOM患儿的中耳液(middle ear fluids，MEF)用于细菌培养，采集前所有患儿均未接受抗生素治疗。鼓膜穿刺由耳鼻咽喉科医师判断并执行；自发性鼓膜穿孔的患者，在穿孔24 h内获得拭子。抗生素使用史被定义为在招募事件之前的3个月内接触过抗生素。通过审查儿童初级保健者提供的病历来获得儿童的免疫接种记录。本研究共纳入117例检出肺炎链球菌菌株的患儿，根据血清分型和多位点序列分型将所有受试者分为19A-ST320组(69例)和非-19A-ST320组(48例)。

1.2 试剂和仪器 哥伦比亚血平板(重庆庞通公司)；VITEK-2全自动微生物分析仪(法国梅里埃公司)，DM2000显微镜(德国徕卡公司)，PCR扩增仪(美国伯乐公司)，棋盘式分型系统试剂盒(丹麦国家血清研究所)，QIAamp DNA Mini kit核酸提取试剂盒(德国凯杰公司)，肺炎链球菌血清分型引物[生工生物(上海)股份有限公司]，Taq DNA聚合酶(美国赛默飞世尔科技有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离鉴定：用无菌拭子对每个MEF样品进行取样并保存在琼脂凝胶中，将其置于微生物实验室进行培养。用标准微生物学方法鉴定肺炎链球菌分离株，包括革兰氏病菌形态学、光学敏感性、胆汁溶解度、抗原性检测及生物化学方法。

1.3.2 血清分型检测：采用特异性血清荚膜膨胀试验法检测肺炎链球菌的血清分型，挑取单菌落制成菌悬液(浓度约为0.5麦氏单位)，取3 μl放置于载玻片上，分别加入3 μl纵列和横行分型血清池，与菌悬液充分混匀，再加入一接种环0.1 g/dl的亚甲蓝溶液与抗血清混匀1 min，盖上盖玻片，在显微镜下观察是否有荚膜或凝集出现。

1.3.3 多位点序列分型(multilocus sequence types，MLST)检测：MLST引物和方法条件参见http：//spneumoniae.mlst.net，以肺炎链球菌基因组的7个管家基因(aroE，gdh，gki，recP，spi，xpt和ddl)作为目标基因进行PCR扩增，扩增产物进行测序。序列分析使用DNA star软件，将序列提交至MLST数据库(http：//spneumoniae.ml-st.net)可获得相应的肺炎链球菌序列型(sequence type，ST)。

1.3.4 药物敏感试验：按2018年CLSI推荐的MIC法和E-test法进行[6]。采用法国梅里埃VITEK-2全自动微生物分析仪进行试验。判断标准：按CLSI 2018进行判断。

2结果

2.1 一般临床资料 本研究所收集的MEF样本共来自117例AOM患儿，其中男性59例(50.4%)，女性58例(49.6%)；中位年龄为39.9个月(范围为4～71月)，其中>60个月以上儿童的有24例(20.5%)，25～60个月的儿童有52例(44.4%)，13～24个月的儿童有28例(23.9%)，≤12个月的儿童有13例(11.1%)；通过鼓膜穿刺获得标本55例(47.0%)，通过收集从耳朵排出的脓液获得标本62例(53.0%)。

2.2 血清型分析及MLST分析 本组样本共检出8种血清型，包括19A，19F，3， 23F，14，15A，35B和6B，其中19A最常见，共有82例，占70.1%；共检出21种序列型，包括ST180，ST236，ST271，ST320，ST1464，ST7123，ST83，ST873，ST2652，ST3111，ST3164，ST1465，ST8525，ST13，ST2108，ST81，ST242，ST76，ST90，ST63和ST558，其中以ST320最常见，共73例，占62.4%。将两种分型方式相结合，所有样本中共有19A-ST320肺炎链球菌分离株69例(59.0%)，非-19A-ST320肺炎链球菌分离株48例(41.0%)。

2.3 两组临床特征比较 见表1。两组患儿在发病年龄、发病年份及鼓膜自发性破裂发生率方面的差异均具有统计学意义(均P<0.05)，19A-ST320组AOM患儿年龄分布较非-19A-ST320组更低，2013～2014年发病患儿比例更低，鼓膜自发性破裂发生率更高，其差异均有统计学意义(均P<0.05)。两组在性别、疫苗接种、抗生素使用、发热时长、乳突炎及肺炎发病率方面的差异无统计学意义(均P>0.05)。

2.4 抗生素敏感性 见表2。本研究所有菌株对左氧氟沙星、莫西沙星和万古霉素均敏感；对红霉素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的耐药率分别为98.29%和85.47%；对青霉素的耐药率为21.37%；对阿莫西林和头孢噻肟的耐药率分别为67.52%和24.79%；85株肺炎链球菌分离株(72.6%)对至少一种β-内酰胺抗生素具有抗性，108珠肺炎链球菌分离株(92.3%)对多种药物均具有抗性。与非-19A-ST320组比较，19A-ST320组分离株对青霉素、阿莫西林、头孢噻肟和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的敏感度更低，其差异有统计学意义(χ2=4.070～23.019，均P<0.05)；对氯霉素的敏感度更高，其差异有统计学意义(χ2=15.718，P=0.000)。19A-ST320组较非-19A-ST320组具有更高的β-内酰胺抗生素抵抗性和多药耐药性(χ2=25.057，12.344，均P<0.001)。

表1 两组临床特征比较分析[n=117，n(%)]

注：*Fisher精确概率法。

表2 抗生素敏感性分析[n(%)]

注：*Fisher精确概率法，S：敏感，R：耐药，I：中介。

3讨论流行病学调查结果显示19A-ST320肺炎链球菌在许多国家AOM患者中普遍存在[1-3]，既往研究表明在AOM儿童中也观察到19A-ST320肺炎链球菌的存在[5]。本研究结果显示血清为19A、序列型为ST320的肺炎链球菌分型是导致AOM最常见的血清和序列分型，19A-ST320肺炎链球菌分离株在所有样本中所占比例最高，为59%。这提示对于AOM患儿，尤其是未确定细菌分型的患儿，选择对19A-ST320肺炎链球菌敏感的抗生素进行治疗可能是比较可行的。

本研究比较了19A-ST320组与非-19A-ST320组患儿的临床特征，结果显示19A-ST320组AOM患儿发病年龄更小，鼓膜自发性破裂率更高。鉴于既往研究报道1～2岁是儿童AOM的高发期，如不及时治疗，其发展为慢性中耳炎的风险更高[7]。这提示对于年龄较小的AOM患者，更需要明确致病菌的分型，以便选择更合适的抗生素治疗方案，这对改善患者预后至关重要。

随着抗生素的广泛使用，肺炎链球菌对青霉素的敏感性逐渐下降、耐药率逐渐增加。研究表明儿童的耐药情况比成人更严重[8]，但随着PCV7的广泛应用及近年来抗生素临床使用的逐渐合理化，肺炎链球菌的耐药性也有所变化[9]。目前有很多对下呼吸道感染的肺炎链球菌耐药监测研究[10-12]。本研究中所涉及的菌株对左氧氟沙星、莫西沙星和万古霉素均敏感；对红霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑耐药率均处于较高水平，约72.6%分离株对至少一种β-内酰胺抗生素具有抗性，92.3%对多种药物具有抗性，这与既往研究大致相符。同时本研究还比较了19A-ST320肺炎链球菌菌株与非-19A-ST320肺炎链球菌菌株的药物敏感性；结果显示与非-19A-ST320组比较，19A-ST320组分离株对青霉素、阿莫西林、头孢噻肟和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的敏感度均更低，对氯霉素敏感性较高；19A-ST320组较非-19A-ST320组具有更高的β-内酰胺抗生素抗性和多药耐药性。

综上，由于AOM患儿中高耐药性的19A-ST320肺炎链球菌感染比例逐渐提高，儿童宜按时接种肺炎球菌结合疫苗。症状严重的患儿应适当进行鼓膜穿刺、确定致病菌分型以控制病情；还应对19A-ST320肺炎链球菌进行监测以调整预防和治疗策略。最后，本研究存在一定的局限性：本研究仅纳入获得MEF样本的患儿，症状较轻的患儿没有被纳入研究，这对研究结果可能有一定的影响。