宫颈组织HPV DNA与血清Chemerin，Leptin水平联合检测对宫颈癌早期诊断的价值分析*

陈 慎，杜明君，宋雅琴

(珠海市中西医结合医院检验科 珠海市第二人民医院，广东珠海 519000)

宫颈癌是临床妇产科常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织(WHO)的数据，每年约有新增病例53万，约有25万女性因该病死亡。在该病的发生发展过程中，历经癌前病变、早期浸润、浸润癌三个阶段。在早期阶段，临床表现不明显，不易引起患者注意，但早期诊断有利于及早采取有效治疗措施，控制病情发展，甚至可恢复患者健康[1-3]。目前临床诊断宫颈癌的方式主要为阴道镜、宫颈刮片等传统方式，具有漏诊的可能，分子水平检测可避免由于取样位置偏差而导致的漏诊[4]。提高宫颈癌分子诊断的灵敏度与特异度，对于早期发现癌变具有十分重要的意义。大量研究表明[5-6]，宫颈癌组织中的高危型HPV检出率可达99%，高危型HPV感染是宫颈癌发生和宫颈上皮瘤变(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)的重要因素。趋化素(Chemerin)是脂肪因子家族成员，具有促进肿瘤细胞生长增殖的作用，在宫颈癌患者体内水平升高[7]。瘦素(Leptin)具有调节能量代谢的作用，促进新生血管生成，参与肿瘤组织新生血管的形成过程[8]。Chemerin和Leptin均与FIGO分期、肿瘤的侵袭转移相关。本研究探讨HPV DNA，Chemerin和Leptin联合检测对宫颈癌的诊断意义。

1材料与方法

1.1 研究对象 以2015年3月～2018年3月期间我院收治的82例宫颈癌患者为宫颈癌组，选取同期在我院门诊或体检诊断为宫颈上皮瘤变(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)的78例患者为CIN组，另选同期于我院体检正常者76例为对照组。其中宫颈癌组患者根据2000年国际妇产科联盟(federation international of gynecology and obstetrics，FIGO)分期[10]ⅠA，ⅠB，ⅡA，ⅡB和Ⅲ期分别有19例、18例、22例、9例和14例。三组研究对象的年龄、BMI等一般资料差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)，见表1。本研究获得我院伦理委员会批准，所有研究对象已签署知情同意书。

表1 三组研究对象一般资料比较

纳入标准：①宫颈癌组患者均经过病理诊断符合宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南(试行)[9]中关于宫颈癌的诊断标准；②宫颈癌组患者均为首次确诊为宫颈癌；③对照组的血细胞计数、肝肾功能、血脂等均正常。排除标准：①并发妊娠者；②入院前3个月内进行过免疫抑制相关治疗者；③并发其它部位恶性肿瘤或代谢性疾病(如糖尿病等)；入院前进行过放疗或化疗者等。

1.2 方法

1.2.1 仪器、试剂和检测方法

1.2.1.1 HPV DNA检测：应用宫颈采样器于研究对象宫颈口顺时针旋转3～5圈后，立即置入含有保护剂的试管，操作中避免血液及其他宫颈分泌物污染，4℃下保存，14天内进行检测。采用第二代杂交捕获技术(HC2)检测研究对象的高危型HPV DNA的阳性率。

1.2.1.2 Chemerin检测：于清晨空腹时采用肝素抗凝真空采血管采集研究对象的肘静脉血4 ml，4℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液，-80℃下保存待测。应用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清Chemerin水平，检测试剂盒购自Peprotech公司，操作均严格按照试剂盒的操作说明进行，并绘制标准曲线计算Chemerin，全部样品均设立复孔检测。

1.2.1.3 Leptin检测：于清晨空腹时采集研究对象的肘静脉血5 ml置于不抗凝管中，4℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液，-80℃保存待测。应用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清Leptin水平，检测试剂盒购自Peprotech公司，操作均严格按照试剂盒的操作说明进行，并绘制标准曲线计算Leptin全部样品均设立复孔检测。

1.2.2 研究方案

1.2.2.1 比较宫颈癌组、CIN组和对照组三组的HPV DNA，Chemerin和Leptin的水平情况。

1.2.2.2 宫颈癌组中HPV DNA分别联合Chemerin和Leptin的灵敏度和特异度的比较。

1.2.2.3 三者联合诊断宫颈癌的灵敏度和特异度，并绘制ROC曲线进行分析比较。

1. 3 结果判定标准 HPV DNA：14种HPV高危型(16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)检出任一种即判定为阳性；Chemerin>1 865.42 ng/ml判定为阳性；Leptin>9.54 ng/ml判定为阳性；平行联合检测判定：检测方法中任一指标呈阳性即判定为阳性；系列联合检测判定：检测方法中全部指标检测为阳性则判定为阳性。

2结果

2.1 HPV DNA，Chemerin，Leptin水平比较

2.1.1 HPV DNA和Chemerin组间比较：见表2。三组的Chemerin水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)，且宫颈癌组高于CIN组和对照组，CIN组高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。经卡方检验，三组HPV DNA的阳性率不同(P<0.05)，且两两比较，宫颈癌组高于CIN组和对照组，差异均具有统计学意义(P<α’)，CIN组与对照组差异无统计学意义(P>α’)。

表2 三组研究对象的HPV DNA，Chemerin情况比较

注：Chemerin水平，与CIN组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.05。HPV DNA阳性，与CIN组比较，cP<α’；与对照组比较，dP<α’。

2.1.2 Leptin浓度组间比较：见表3。经统计分析，宫颈癌组的中位Leptin浓度高于CIN组和对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，CIN组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 HPV DNA，Chemerin和Leptin分别单独检测的诊断效能 见表4。以病理检查结果作为诊断的金标准，Leptin单独检测的灵敏度最高；HPV DNA单独检测的特异度最高；Leptin单独检测的准确度最高。

表3 三组研究对象的血清Leptin情况比较(ng/ml)

表4 HPV DNA，Chemerin，Leptin分别单独检测的诊断效能[%(n)]

2.3 血清HPV DNA，Chemerin和Leptin联合诊断效能 以病理检查结果作为诊断的金标准，分析HPV DNA+Chemerin，Chemerin+Leptin，HPV DNA+Leptin，HPV DNA+Chemerin+Leptin平行联合检测和系列联合检测的灵敏度、特异度、准确度，见表5，表6。HPV DNA+Chemerin+Leptin平行联合检测的特异度较高，但敏感度较低，HPV DNA+Chemerin+Leptin系列联合检测的敏感度和特异度均较高。

表5 HPV DNA，Chemerin，Leptin平行联合检测的诊断效能[%(n)]

表6 HPV DNA，Chemerin，Leptin系列联合检测的诊断效能[%(n)]

2.4 HPV DNA，Chemerin和Leptin联合检测诊断宫颈癌的ROC曲线分析 HPV DNA+ Chemerin，Chemerin+Leptin，HPV DNA+Leptin，HPV DNA + Chemerin+Leptin平行联合检测的ROC曲线下面积依次为0.735，0.717，0.654和0.818，三者平行联合检测的曲线下面积高于任意两者平行联合检测(P<0.05)，见图1。系列联合检测的ROC曲线下面积依次为0.709，0.697，0.650和0.860，三者系列联合检测的曲线下面积高于任意两者系列联合检测(P<0.05)，见图2。

图1平行联合检测ROC曲线图 图2系列联合检测ROC曲线图

3讨论宫颈癌是临床妇科的一种常见肿瘤，发生于女性生殖系统，其发病率与病死率均较高。据有关统计[11-12]，在发展中国家宫颈癌在女性恶性肿瘤中的发病率仅次于乳腺癌，死亡率仅次于乳腺癌与肺癌，我国每年新发病例约有10万，占世界新发病例的1/5。宫颈癌早期筛查可早期发现病例，积极治疗，对于提高宫颈癌患者的生活质量及生存时间均具有重要意义。目前，临床主要的诊断方法有阴道镜、宫颈刮片等，但分子生物学检测，能够从血清水平对指标进行检测，从而避免由于视野局限或取样位置不准确等所造成的漏诊。

本研究结果显示，宫颈癌组的HPV DNA阳性率高于CIN组和对照组(P<0.05)，反映出其与宫颈癌可能具有一定相关性。研究认为[13]，HPV感染是诱发宫颈癌的重要启动因素，其持续感染导致机体免疫功能降低，宫颈局部微环境发生变化，HPV DNA整合在宿主染色体脆位区，引起患者癌基因E6，E7过度表达，并在其他致癌因素辅助下抑制抑癌基因p53，Rb等表达，激活端粒酶活性，通过抑制细胞凋亡、逃逸机体免疫监视等导致细胞周期调控异常演化为癌细胞。韩钦[14]的研究也显示，HPV检测对宫颈癌具有诊断意义，可用于宫颈癌的早期筛查。

Chemerin是脂肪因子家族的一员，具有趋化白细胞的功能，因此也被命名为趋化素，参与代谢综合征以及相关疾病的病理生理过程，亦可通过活化G蛋白偶联受体ChemR23，趋化不成熟的树突细胞、巨噬细胞到达肿瘤部位，参与肿瘤细胞的免疫过程；与内皮细胞膜上的CMKLR1受体集合，起到诱导内皮细胞增殖和促进新生血管丛形成的作用，促进肿瘤细胞的增殖生长[7，15]。本研究中，研究对象的血清Chemerin水平，宫颈癌组高于CIN组和对照组(P<0.05)，CIN组高于对照组(P<0.05)，表明随着疾病的发生发展，患者的血清Chemerin水平升高，对于宫颈癌的预测有一定意义。刘雪峰等[15]的研究也显示，宫颈癌患者的血清Chemerin水平明显升高，且与FIGO分期关系密切，对宫颈癌的进展具有指导作用。

Leptin是一种非特异性促肿瘤细胞生长因子，具有促进血管生成、增加细胞的侵袭性、促进肿瘤细胞的增殖分化等作用，且还通过JAK/STAT，HIF，TGF-β等通路参与肿瘤的侵袭、转移等[16]。本研究结果表明Leptin在三组中的水平有所不同(P<0.05)，表明其可能参与宫颈癌的发生发展。张婧等[16]学者通过对宫颈癌患者血清和肿瘤组织中Leptin的表达水平研究也发现，比正常人升高，与本研究结果类似。

本研究以病理诊断作为金标准，对HPV DNA，Chemerin和Leptin检测用于宫颈癌诊断进行分析发现，三者的灵敏度、特异度及准确度均不高，尚不足以作为单独检测诊断宫颈癌的依据。通过分析联合检测的诊断效能发现，三者系列联合检测的敏感度(74.39%)、特异度(74.36%)和准确度(74.38%)高于任意两者系列联合检测，且敏感度与准确度均高于三者平行联合检测，特异度则相差无几，同时系列联合检测的ROC曲线下面积(0.860)高于平行联合检测(0.818)，因此三者系列联合检测诊断效能较高，具有较高的诊断价值，三者系列联合检测更加适用于宫颈癌的早期诊断。

综上所述，HPV DNA，Chemerin，Leptin与宫颈癌的发生发展密切相关，三者系列联合检测均可提高诊断效能，对于宫颈癌的早期诊断、及早干预具有积极意义。