慢性心力衰竭患者外周血细胞中线粒体转录因子A的表达

李硕 李晓慧 黎百志 严亚琪 董文超 单伟超 刘超 王鹏飞 丁振江王瑞鹃

承德医学院附属医院本部心脏内科（河北承德067000）

慢性心力衰竭是导致患者死亡的一个非常重要的原因［1-3］，是心血管疾病发生发展的终末阶段，形势尤为严峻。心室重塑、心肌能量代谢障碍、神经体液调节等多种机制共同作用引起慢性心力衰竭，其中心肌细胞对氧化应激的反应导致以线粒体为靶点的渐进性细胞改变，诱发线粒体凋亡通路，进而引发慢性心力衰竭的病理过程是重要的机制之一［4-5］。

心脏是个高耗能器官，正常的心肌细胞需要不断地合成ATP 从而提供充足的能量，进而维持心脏正常的细胞活力和泵功能。线粒体占心肌细胞总体积的30%，能够为心脏提供大约90%的能量，在细胞生命活动中发挥着举足轻重的作用。因此，一旦线粒体功能障碍必然会影响心肌细胞的功能［6］。

线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）位于人和小鼠10 号染色体长臂21 区上，长度为10～25 kb，是一种对DNA 有高亲和力的高迁移率（HMG）蛋白，能够通过与线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的LSP 和HSP 上游的识别位点的特异性结合来刺激转录［7］，是调控mtDNA 拷贝数和影响线粒体功能的重要转录因子［8］。小鼠模型中，TFAM 基因敲除导致mtDNA 拷贝数缺失及线粒体转录能力下降，进而引起扩张型心肌病。而TFAM 基因过表达能够改善mtDNA拷贝数缺失，维持线粒体功能，抑制心肌细胞肥大，间质纤维化及心肌凋亡［9］。基于这些发现，笔者认为TFAM 可能是慢性心力衰竭患者中线粒体功能障碍的线索。本研究通过利用RT-PCR 技术分析线粒体功能障碍的外周血细胞TFAM mRNA表达，阐明其与慢性心力衰竭的关系，评估其临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 连续纳入2017年8月至2018年8月于承德医学院附属医院心脏内科住院的慢性心力衰竭患者63 例作为心衰组，其中男32 例，女31 例。根据患者既往是否患有冠心病史，分为缺血性心衰组33 例、非缺血性心衰组30 例。并依据美国纽约心脏病协会（NYHA）分级标准将心衰患者分为NYHA Ⅱ级8 例、Ⅲ级16 例、Ⅳ级39 例。入选标准：参考2014年中国心力衰竭诊断和治疗指南［10］。排除标准：合并有重度瓣膜病、肥厚或限制性心肌病、缩窄性心包炎、心源性休克、急性心肌梗死、严重肝功能不全［丙氨酸氨基转移酶（ALT）或门冬氨酸基转移酶（AST）＞5 倍正常上限］、严重肾功能不全（肌酐＞220 mmol/L）、各种恶性肿瘤、结缔组织病、心肌炎、外伤、线粒体相关疾病、妊娠、哺乳。同期住院心功能正常患者94例作为对照组，其中男44 例，女50 例。患者均签署知情同意书，并且本研究已通过医院伦理委员会批准。

1.2 流行病学与临床资料收集 记录研究对象的资料：（1）一般资料：年龄、性别、身高、体质量、收缩压、舒张压、心率、体质量指数、心功能分级、基础疾病、既往病史、口服用药等情况；（2）常规生化指标：白细胞计数、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、肌酐（Cre）、尿酸、ALT、AST、脑钠肽（BNP），采用我院生化室检测值，日立全自动7600 生化分析仪，试剂为中生公司有效期内产品；（3）超声心动图：由我院超声科进行检查，收集左室射血分数（LVEF）、左室舒张末期前后径（LVEDD）等数据。

1.3 方法

1.3.1 收集外周血样本 外周血采集：所有入选患者均在入院后于次日晨起静卧1 h 后，采集2 mL外周静脉血，用肝素钠抗凝，混匀后置于2 mL EP管内，标记后放入实验室-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 实时RT-PCR检测两组外周血TFAM mRNA的表达水平 按照Qiagen 血液基因组RNA 提取试剂盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit）说明书操作提取外周血总RNA，UV240 紫外分光光度仪读取其OD260/OD280 的比值。cDNA 合成严格按照FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒（Fast Quant RT Kit）说明书进行，合成的cDNA 储存在-20 ℃用于Combasz 480 实时PCR 定量。根据引物（由生工生物工程股份有限公司提供）设计的原则，TFAM上游引物：5′-GCATCTGGGTTCTGAGCTTT-3′，下游引物：5′-CCGAGGTGGTTTTCATCTGT-3′。管家基因上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，管家基因下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR 流程：PCR 溶液系统置于荧光PCR 仪行PCR 扩增，反应条件：预热95 ℃15 min ，变性、退火、延伸反复45 循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA 片段。实验测得TFAM 的特异性扩增曲线和溶解曲线。得到每个样本的CT值，分别计算对照组目的基因和管家基因的平均CT 值，以此为参照，依据公式2-ΔΔCT计算出每个标本TFAM mRNA 的表达水平［11］。

1.4 统计学方法 采用统计软件SPSS 21.0 软件包，计量资料：正态分布：均数±标准差表示，2 组间均数比较选择t检验。多组间均数比较采用单因素方差分析。偏态分布：四分位数表示，选择秩和检验。计数资料：例（%）表示，率或构成比的比较采用χ2检验。两者间相关性采用Spearman 相关性分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 实验组和对照组一般资料比较：结果显示两组在性别、高血压病史、收缩压、舒张压、总胆固醇、饮酒史、ALT 方面差异无统计学意义。实验组TFAM mRNA 表达（1.144±0.565）低于对照组（1.431 ± 0.868），差异具有统计学意义（P＜0.05）。与非缺血性实验组（n=30）相比，缺血性实验组（n=33）年龄偏大［（72.606 ± 10.97）vs.（60.867±12.54），P＜0.05］、BNP较低［（1 184.57± 900.52）vs.（1 416.16 ± 852.662），P＜0.05）］、LVEF 较高［（46.12 ± 11.185）vs.（43.30 ± 15.257），P＜0.05］，TFAM mRNA 表达较高［（1.242 ± 0.526）vs.（1.036±0.594），P＜0.05］。见表1。

2.2 不同心功能NYHA分级组TFAM mRNA、BNP水平 不同心功能NYHA 分级组患者外周血BNP、TFAM mRNA 水平比较差异具有统计学意义（P＜0.01），外周血BNP 水平随着NYHA 分级升高而升高，TFAM mRNA 表达随着NYHA 分级升高而降低，见表2。

表1 各组一般资料比较Tab.1 Comparison of general data in groups ±s

表1 各组一般资料比较Tab.1 Comparison of general data in groups ±s

注：与非缺血性心衰组相比，*P ＜0.05；与对照组相比，#P ＜0.05

临床资料年龄（岁）男性［例（%）］高血压病［例（%）］糖尿病［例（%）］吸烟史［例（%）］饮酒史［例（%）］体质量指数（kg/m2）收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）Cre（mmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）BNP（pg/mL）TFAMmRNA LVEF（%）LVEDD（mm）心衰组（n=63）63.36±9.51 32（50.79）38（60.32）27（42.86）#10（15.87）#15（23.81）23.28±3.587#133.23±23.06 82.75±15.27 3.86±1.055 1.34±0.682#98.58±52.194#43.97±69.666 40.259±72.351#1 294.85±878.755#1.144±0.565#44.778±13.246#57.762±12.721#缺血性心衰组（n=33）72.606±10.97*16（48.48）20（60.61）16（48.48）5（15.15）8（24.24）22.448±2.69 136.06±21.68 81.54±13.299 3.842±0.894 1.396±0.653 103.55±50.83 33.936±18.165 26.936±17.897 1 184.57±900.52*1.242±0.526*46.12±11.185*55.818±13.987非缺血性心衰组（n=30）60.867±12.54 16（53.33）18（60.00）11（36.67）5（16.67）7（23.33）24.196±4.220 130.13±24.46 84.06±17.314 3.874±1.224 1.281±0.721 93.11±53.98 55.073±98.850 54.913±102.048 1 416.16±852.662 1.036±0.594 43.30±15.257 59.900±11.002对照组（n=94）61.74±7.31 44（46.8）54（57.45）10（10.64）28（29.79）24（25.53）25.33±3.223 136.83±21.33 83.40±11.17 4.26±0.896 2.03±1.508 63.82±14.462 31.26±14.261 22.991±8.974 37.77±28.25 1.431±0.868 63.440±5.192 49.223±4.494

表2 心衰患者不同心功能分级组TFAM mRNA、BNP 水平Tab.2 TFAM mRNA and BNP levels in heart failure patients with different cardiac function grading groups ±s

表2 心衰患者不同心功能分级组TFAM mRNA、BNP 水平Tab.2 TFAM mRNA and BNP levels in heart failure patients with different cardiac function grading groups ±s

注：与NYHA 分级Ⅱ级组比较，*P＜0.05；与NYHA 分级Ⅲ级组比较，△P＜0.05

NYHA 分级ⅡⅢⅣ例数8 16 39 BNP 155.66±25.57 720.81±319.72*1 764.04±762.60△TFAM mRNA 1.91±0.178 1.48±0214*0.849±0.486△

2.3 不同LVEF、LVEDD 分组与TFAM mRNA水平 分别按LVEF 和LVEDD 进行分组分析，研究表明LVEF ≤40%组外周血TFAM mRNA 水平低于LVEF＞40%组（P＜0.05）。LVEDD 50 ～70 mm组外周血TFAM mRNA 水平低于LVEDD ＜50 mm组（P＜0.05）；LVEDD ＞70 mm 组外周血TFAM mRNA 水平低于LVEDD ＜50 mm 组及LVEDD 50～70 mm 组（P＜0.05），见表3。

2.4 TFAM mRNA 水平与不同变量的相关性分析 结果显示TFAM mRNA 水平与LVEF 呈正相关（r=0.429，P＜0.001），与LVEDD、BNP、糖尿病呈负相关（r=-0.277、-0.242、-0.173，P＜0.05）。见表4。

3 讨论

慢性心力衰竭患者发病率呈逐年上升趋势，是当今临床研究中重要的课题之一［10］。近年来HUANG 等［12］研究表明，外周血mtDNA 拷贝数与慢性心力衰竭呈负相关，外周血mtDNA 拷贝数越低，慢性心力衰竭患者心功能越差。明确了mtDNA 与慢性心力衰竭之间具有相关性。但是TFAM mRNA 在慢性心力衰竭中的表达及作用尚未明确。本研究旨在通过横断面分析，探讨慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表达，评估其临床价值。结果显示与对照组相比，慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表达水平降低。同时随着NHYA 分级升高，外周血TFAM mRNA 表达逐渐降低。

表3 心衰患者不同LVEF、LVEDD 分组TFAM mRNA 水平Tab.3 TFAM mRNA level in different LVEF and LVEDD groups of heart failure patients ±s

表3 心衰患者不同LVEF、LVEDD 分组TFAM mRNA 水平Tab.3 TFAM mRNA level in different LVEF and LVEDD groups of heart failure patients ±s

分组LVEF（%）＞40≤40 LVEDD（mm）＜50 50 ～70＞70例数TFAM mRNA 40 23 1.389±0.434 0.717±0.514*15 39 9 1.737±0.250 1.011±0.507△0.730±0.444#

表4 TFAM mRNA 水平与不同变量的相关性分析Tab.4 Analysis of correlation between TFAM mRNA level and different variables

TFAM 在细胞核内产生，被转移进入线粒体基质，通过与mtDNA D 环内的启动子区结合而激活线粒体转录。在调控mtDNA 稳定性、维持其完整性中起着关键性作用［13-15］。近年来，已有研究报道TFAM 作为线粒体核蛋白的主要蛋白，能够保护线粒体免遭损伤，不仅因为大量存在的TFAM能够包绕mtDNA 形成环状球体，并能将数个球体压缩形成类核从而减少ROS 的产生［16］，而且进入线粒体内的TFAM 还可以刺激抗氧化酶的产生，如谷胱甘肽过氧化物酶［17］，同时还可以抑制钙离子通道，减少细胞内钙内流［18］。TFAM 除了上述作用外，还参与多种疾病，如线粒体脑病、癌症等。有较多关于TFAM 表达升高或降低参与这些疾病中的报道。NISHIO 等［19］研究发现糖尿病大鼠心肌细胞由于TFAM 与mtDNA 启动子结合活性的降低，导致线粒体功能障碍，氧化应激增加，从而使TFAM 表达下降。

本研究结果显示慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表达降低，可能因为慢性心力衰竭中，线粒体内通过电子传递链产生的ROS 增多，其能够通过攻击脂质、蛋白质和mtDNA，导致细胞功能障碍和/或死亡［20-21］，从而进一步导致ROS 产生增加并形成mtDNA 损伤的恶性循环。研究［14，22-23］结果发现TFAM 过表达能够改善mtDNA 拷贝数缺失。因此，在心力衰竭初期，TFAM通过补偿机制过量产生调控mtDNA 拷贝数，维持mtDNA 的完整性和稳定性，这些反过来又有助于减少氧化应激的产生［14］。但随着心力衰竭程度逐渐加重大量产生ROS时，反而导致TFAM表达降低［24］。因此，慢性心力衰竭时TFAM mRNA表达下降。这一结果与心梗后心力衰竭小鼠模型中的研究结果相一致［25］。

此外，研究发现缺血性心肌细胞中TFAM表达水平下降，这与笔者既往所做的研究结论一致［26-27］。然而本研究结果显示，与非缺血性实验组相比，缺血性实验组TFAM mRNA 表达较高，可能因为缺血性实验组年龄偏大、BNP 较低、LVEF 较高，因此与非缺血性实验组相比，缺血性实验组中患者心功能严重程度较轻，从而有可能导致缺血性实验组中TFAM mRNA 表达较高。

端粒缺陷小鼠线粒体生物合成受损，包括mtDNA 含量下降，导致心脏结构发生变化，如左室直径增加、左室壁变薄、部分缩短减少。KNEZ等［28］的研究表明外周血mtDNA 含量与心脏结构和功能相关，能够作为左室直径及体积重要预测因子。TFAM 作为mtDNA 的调控因子，其与心力衰竭中心脏结构变化的相关性研究已有报道。研究［29-30］显示在组织特异性TFAM 敲除小鼠中，mtDNA 耗尽后呼吸链功能下降导致线粒体心肌病，其特点是左室扩张和心肌重量增加。本研究结果发现：随着LVEF 减低、LVEDD 增大，TFAM mRNA 含量逐渐减少，TFAM mRNA 水平与LVEF 呈正相关，与LVEDD 呈负相关。因此，本研究发现，在一定程度上能够说明TFAM 与左室重构有联系［23］。值得注意的是，CHENG 等［31］研究发现中年时某些危险因素的存在，包括高血压和糖尿病，也与左室结构变化有关。因此，阐明TFAM 在左室重构和功能障碍进展到症状性心力衰竭中的作用需要进一步的研究。

BNP 是心肌细胞分泌的一种激素［32］。BNP 水平与心力衰竭严重程度相关，是整个心力衰竭阶段的预测因素［33］。本研究结果表明BNP 与TFAM mRNA 呈负相关，因此通过联合检测BNP、TFAM mRNA 水平能够更加准确地诊断及评估心力衰竭，为临床医师提供更全面的诊疗信息。

本研究的局限性在于：本研究中样本量偏小，使检验效能减低。本研究是一个横断面研究，虽然本文的数据表明慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 表达下降，但是是由于外周血TFAM mRNA 表达下降导致慢性心力衰竭，还是慢性心力衰竭引起患者外周血TFAM mRNA 表达下降，目前尚未见明显阐述，并且本研究对于药物治疗后没有进行进一步研究，针对治疗后外周血TFAM mRNA 表达是否存在变化，需要进行深入研究。

综上所述，在慢性心力衰竭进展过程中，外周血TFAM mRNA 表达进行性下降，TFAM 在各种病因引起的心肌的病理变化中起着重要的作用，可能成为慢性心力衰竭的新型标志物及治疗的靶点。但慢性心力衰竭和TFAM 之间的因果关系还需进一步研究。