全麦发酵面团菌群结构分析及对风味物质的影响

尚 英 熊荣园 -

(南充职业技术学院，四川 南充 637131)

一直以来，精细化饮食是中国的主流饮食文化，小麦在精细化加工过程中，如麸皮、皮层、胚芽等具有营养价值的物质均被转移到饲料等副产品中，造成营养物质的浪费[1]。但随着现代营养学和预防医学的研究，越来越认识到全谷物非精细化饮食可以有效地预防多种慢性疾病的发生，如提高食品中的全谷物含量可有效降低糖尿病的发病率[2]。小麦粉及其制品作为中国的主食之一，对全麦粉的成分研究[3]指出，全麦粉中含有丰富的三甲基甘氨酸和胆碱，长期服用全麦粉可以有效预防新生儿的神经血管缺陷问题，同时可减少成年人的高血压和心血管疾病发病概率[4]。《中国居民膳食指南(2016)》也提倡人们将全谷物作为膳食重要组成成分[5]。全麦面粉保留了天然小麦的全部成分，与精制面粉相比，可提供更多的B族维生素、矿物质、膳食纤维等营养成分及有益健康的植物化学物[6-7]。全麦饮食是一种安全有效的健康生活方式[8]。

目前国内的发酵面粉制品主要采用精制面粉，且多数采用单一的商业酵母菌发酵[9-10]。发酵速度快，但风味和口味比较单一[11-12]。欧美国家在使用全麦面粉代替精细化面粉制作烘焙食品的研究较为深入，而国内关于应用全麦面粉开发烘焙食品的研究刚起步[13]。如将全麦发酵食品有效利用起来，不仅可以提高面制品的经济附加值，同时可以有效提高人们的合理膳食水平，保证了人们的健康[14-15]。本研究拟以四川南充高坪区域特色“老面”作为传统发酵剂和全麦面粉制成面团，对发酵面团中的酵母菌、乳酸菌及其他细菌进行分离纯化与鉴定，采用宏基因组学的方法解析该面团中的细菌菌群结构，并确定其核心菌属/菌种。同时将市售商业发酵剂与全麦面粉制成面团，比较2种面团的风味物质含量。旨在为全麦面粉的应用提供理论支持，同时为全麦发酵食品的研究和开发提供依据，以期为改善工业化全麦发酵面团的质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

去离子水：校食品检测与饲料监测中心制备；

全麦面粉：市售一级，山东德运面粉有限公司；

传统发酵剂：老面，校学生食堂提供；

商业酵母菌剂：安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。

1.2 试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒：美国西格玛奥德里奇有限公司；

胶回收试剂盒：北京天根生物科技公司；

DNAPolymerase、dNTPs、10×Taqbuffer、Taq酶、Tris-饱和酚、溶菌酶、分子生物学试剂：大连宝生物Takara有限公司；

其他试剂：分析纯，吴江新源化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

微量分光光度计：NanoDrop2000型，美国Thermo Fisher公司；

水平电泳系统：JY-SPCT型，北京君意东方电泳设备有限公司；

凝胶成像仪：WD-9403S型，北京市六一仪器厂；

第二代高通量测序仪：Miseq型，美国Illumina公司；

恒温培养箱：SHP-180型，杰瑞尔电器有限公司；

气质联用色谱仪：5977A型，美国安捷伦科技有限公司；

去离子纯水机：Eco-Q型，上海和泰仪器有限公司；

醒发箱：SMF-32B型，无锡胜麦机械有限公司；

冷冻离心机：5415R型，德国Eppendorf公司；

超低温冰箱：DW-86L959型，青岛海尔公司；

超净工作台：SJ-CJ-2F型，苏州苏洁医疗公司。

1.4 方法

1.4.1 面团的制备

(1) 工艺流程

调制面团(面粉500 g，纯净水240 mL)→和面(20 min)→成型→一次醒发(相对湿度85%，36 ℃，20 min)→揉制(10 min)→二次醒发(相对湿度85%，36 ℃，30 min)

(2) 操作要点：将全麦面粉和传统老面放入和面缸中，使用搅拌机进行和面，先慢速搅拌10 min，再快速搅拌10 min，和面后应达到面筋充分扩展，表面无断裂痕迹，面团手感柔和，表面光洁。通过2次充分醒发提高面团的发酵完整度，同时考虑避免出现过度发酵的情况出现。

商业酵母发酵面团采用全麦面粉与商品化酵母菌剂混合后发酵的方法，具体加工流程同传统老面发酵流程。

1.4.2 面团样品的采集、贮藏及预处理 从实验室温箱中取出传统发酵完全的全麦面团样品，无菌称取100 g左右的面团，中心位置、中间层和表面分别挖取10 g面团放入锥形瓶，重复以上操作5次，每次采样的面团为测序目标样品，依次命名为1～5号样品。向采集的面团中加入190 mL无菌生理盐水，摇床内持续摇动20 min，使面团充分吸收水分并分散均匀。从分散液中取5 mL液体装入15 mL无菌离心管中，-4 ℃冰箱备用。

1.4.3 面团总基因组提取 将1.4.2制备的分散液(在冰箱的贮藏时间不超过48 h)于4 ℃，10 000 r/min离心10 min，收集沉淀于4 ℃冰箱中备用。采用试剂盒法提取总基因组，具体方法参考试剂盒说明书。采用1%琼脂糖凝胶电泳(120 V，60 min)进行提取基因组检测，电泳结果显示条带完整，测定浓度后写明样品名称为传统面团和商业面团，放入-20 ℃冰箱，准备测序。

1.4.4 MiSeq宏基因组测序及生物信息学分析 以1.4.3中提取的细菌总基因组为模板，扩增V3～V4区(250 bp左右)的基因片段。引物扩增序列为：GGYAAGNGGG GYDTA；TACAATCTATCVGGGTCN。PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳切胶回收后，立即使用Illimina MiSeq PE 250进行高通量测序。测序完成后，先进行质控去除低质量序列。使用Flash软件进行序列拼接，得到分析所用总序列后进行聚类，得到各样品的总OTU，采用Qiime软件进行分析，分析内容包括：绘制稀疏曲线、Alpha多样性分析、科水平和种水平的物种多样性分布统计。

1.4.5 面团挥发性风味物质的测定 称取5 g面团于顶空样品瓶(15 mL)中，60 ℃水浴加热35 min。通过SPME针头将萃取头伸入样品瓶顶空部分，萃取25 min，转至气相色谱仪，240 ℃解析7 min。色谱条件：色谱柱35 m×0.22 μm×220 μm，进样口最终温度240 ℃，起始温度50 ℃，静止3 min，以3 ℃/min加热至55 ℃，再以4 ℃/min 加热至100 ℃，之后以5 ℃/min加热到230 ℃，静止3 min，载气He，保持0.5 mL/min流量体积，采用不分流模式，2 μL进样量。质谱条件：使用电子轰击离子源(EI)为电离方式；接口温度240 ℃；保持离子源温度190 ℃；电子能量60 eV；扫描范围m/z41～488。

1.5 数据分析

试验数据采用Graphpad Prism 7进行处理，采用One-Way ANOVA进行显著性分析，使用Origin 2017进行绘图。

2 结果与分析

2.1 风味物质组成

由表1可知，在全麦传统发酵面团和全麦商业发酵面团中分别检测出45，36种风味物质，其中包括：芳香、酸、酯、酮等8类。数量上，2种面团中烃类的含量最多，其次为醛类和醇类物质，醚类物质最少。总含量上，传统发酵面团的风味物质含量最多，比商业发酵面团多9种，烃类物质为含量差异最多的物质。风味物质的产生与微生物的作用有关，其中全麦面粉中的糖类物质经微生物发酵，可以产生酸和醇类化合物，而产生的酸和醇类化合物可进一步反应产生酯类化合物；微生物通过醛醇缩合反应、氨基酸的Strecker降解和高级醇氧化都可产生多种羰基化合物。

表1 风味物质分析结果†

† “—”表示未检测到。

2.2 宏基因组法分析菌群结构

在科分类水平上(图1)，所有测序样品中的主要细菌科为乳酸菌科，所占比例均为90%以上；第二为醋酸杆菌科，所占比例为5%左右；此外，所有样品中还含有芽孢杆菌科(1%)和明串珠菌科(1%)的细菌。属分类水平分析结果如图2所示，5个样品中含量最高为乳杆菌属，达88%以上，其他含量较高的菌属分别为魏氏菌属、醋杆菌属、明串珠菌属等。通过菌群分类研究结果显示，在全麦发酵面团样品中含量最高的菌群主要是乳酸杆菌，该菌可能在全麦面团的发酵过程中扮演重要的角色。

2.2 乳酸菌种的分类水平分析

上述研究已证实乳酸菌为全麦传统发酵面团中主要的细菌核心菌群，乳酸菌种的含量情况如图3所示，样品中分别含有植物乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、旧金山乳杆菌、德氏乳杆菌、面包乳杆菌，其中含量最高的菌种为短乳杆菌，达35%～39%，其次为发酵乳杆菌，达21%～23%，植物乳杆菌和旧金山乳杆菌含量相对接近，均在10%～16%。

图 1 科水平的物种分布情况

图2 属水平的物种分布情况

图3 乳酸菌种水平分布情况

3 结论

从试验可以看出，传统发酵全麦面团除酵母菌外还含有较多的乳酸菌，用传统发酵菌剂发酵全麦面团比用商业酵母菌剂在风味物质的总量以及种类方面较优，表明传统发酵菌株对全麦面制品的风味更有利。可能是商业酵母菌剂只有酵母菌，使得发酵的全麦面团风味物质种类较少。而传统发酵菌剂含有的乳酸菌，使全麦面团酸化产生多种有机酸，有利于醇、酮、醛和酯等风味物质的生成。随着全社会对人群健康的重视，全麦发酵面团的研制，能够带来一定的健康价值和经济价值，同时还具有广泛的应用价值。后续将对全麦发酵面团的传统发酵菌剂的用量、发酵条件和制作工艺对风味物质的影响进行重点研究，以便更好地为全谷物饮食的开发和利用提供理论基础。