知母总皂苷对佐剂型关节炎模型大鼠琥珀酸/GPR91/IL-1β通路的影响❋

潘 婷，陈 欢，刘攀旺，徐世军△

(1.成都中医药大学药学院，成都 611137；2.成都中医药大学中医脑病药物整合转化研究所，成都 611137)

关节滑膜增生和成纤维细胞(synovial fibroblast cell，FLS)炎性浸润是类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的主要病理特征[1-2]。炎症的发生发展与细胞的能量代谢状态极为密切[3]。琥珀酸由琥珀酰CoA合成酶催化琥珀酰CoA生成，同时高能硫酯键水解生成GTP。研究发现，琥珀酸在RA患者关节滑膜液中大量累积，并被认为是导致滑膜病理变化的关键因素之一[4-5]。琥珀酸通过G蛋白偶联受体91(G protein-coupled receptor 91，GPR91)促进炎性因子IL-1β释放，启动并加速关节滑膜病变[6-7]。知母是历代治疗痹症的常用高频中药，也是治痹经方桂枝芍药知母汤、白虎加桂枝汤、通阳宣痹汤等关键药物，具有显著的抗炎、免疫调节、影响皮质激素及血糖水平的作用[8-10]。皂苷是其含量最高、种类最多的成分，具有明显抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂的药理作用[9]，但鲜少有关于知母皂苷抗RA的研究。

1 材料

1.1 动物

32只雄性SPF级SD大鼠，体质量160～200 g，购于四川省医学科学院实验动物研究所(动物合格证号0010716)。大鼠均饲养于22 ℃～24 ℃，明暗周期为12 h/12 h的环境中，自由摄食饮水。

1.2 药品与试剂

知母总皂苷(宝鸡辰光生物制药股份有限公司，批号20160917)；醋酸地塞米松(浙江仙琚制药股份有限公司，批号161231)；完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)(sigma公司，货号F5881-10 ml)；GPR91抗体(Abcam公司，批号ab140795)；IL-1β ELISA试剂盒(MultiSciences，批号2301B71055)；琥珀酸(成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-11052307)；富马酸(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号F-016-170426)；琥珀酸脱氢酶测试盒(南京建成生物科技有限公司，批号A022)。

1.3 主要仪器

PV-200足趾容积测量仪，成都泰盟；Agilent1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Ultimate AQ-C18，月旭科技股份有限公司；CX22型显微镜(带数码成像系统)，德国LEICA公司。

2 方法

2.1 造模与分组

动物适应性喂养3 d后，根据体质量和正常足容积完全随机分成4组，通过抓阄确定组名，分别为空白组(NG)、模型组(AA)、阳性组(DXMS，0.0875 mg/kg)、知母总皂苷组(TT，200 mg/kg)每组各8只。除NG组大鼠右后足足跖皮下注射0.1 ml生理盐水外，其余各组大鼠均于同一位置缓慢注射0.1 ml CFA。造模第14天开始药物干预，给药体积为10 ml/kg，NG组和AA组给予蒸馏水，每日1次，连续28 d。

2.2 观察指标与方法

2.2.1 足肿胀度 造模前测定大鼠右后足足容积2次，计算均值作为正常足容积。造模后每隔6 d于同一位置测定足容积1次。以造模后足容积与正常足容积的差值作为大鼠足肿胀度。

2.2.2 足围 造模前，采用皮尺测量大鼠造模侧足跖部周长2次，求取平均值当作正常足围。造模后每隔6 d测定大鼠足围1次，以造模后足围与正常足围的差值作为足围变化。

2.2.3 大鼠踝关节滑膜的病理形态学观察 表1显示，末次给药1 h后处死大鼠，剪取大鼠右后足踝关节，注射4%多聚甲醛溶液于关节腔内并浸泡于固定液中。脱钙后经石蜡包埋、切片，用苏木精-伊红进行染色、封片，最后镜检。

2.2.4 外周血清IL-1β含量 末次给药1 h后取腹主动脉血，3500 r/m离心10 min取上清液，按ELISA试剂盒说明书步骤检测外周血清中IL-1β含量。

表1 滑膜组织病理评分标准

2.2.5 滑膜组织中琥珀酸脱氢酶活性及琥珀酸、富马酸含量测定 组织匀浆液制备：将滑膜组织用液氮冻硬后立即研磨成粉，按1∶10的比例(W/V)加入生理盐水进行匀浆。SDH酶活性检测：取滑膜组织匀浆液，参照说明书检测SDH酶活性。琥珀酸、富马酸含量测定：吸取250 μL匀浆液于EP管中，添加等量0.5 mol/L高氯酸混匀。冰浴10 min后，14000 g 4℃离心20 min，取300 μL上清液于进样瓶。标准品配制：采用双蒸水配制琥珀酸(1800 μmol/L)与富马酸(200 μmol/L)标准品。流动相配制：称量磷酸二氢钾加超纯水定容，调PH至2.5，过0.45 μm的微孔滤膜，超声15 min。等度洗脱，流速1 ml/min，波长210 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。

2.2.6 免疫组化法检测滑膜组织GPR91蛋白表达 2.2.3项下石蜡切片经脱蜡、水化处理后，采用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液(pH=6.0)修复抗原。随后加入兔抗GPR91抗体，4 ℃孵育过夜，加入适量生物素标记的二抗室温孵育15 min，HRP工作液孵育15 min。最后进行DAB染色，苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检。以细胞膜出现棕黄色为阳性表达，采用image-pro Plus 6.0软件测定GPR91蛋白阳性表达的平均光密度，并用IOD值表示。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 知母总皂苷对模型大鼠足肿胀度及足围的影响

表2、3显示，致炎后模型大鼠足部出现明显红肿，AA组大鼠足肿胀度逐渐增加，第28天达到峰值；经知母总皂苷治疗4周后，大鼠肿胀度较模型组明显降低(P<0.05)。与NG组比较，AA组大鼠足围显著增加(P<0.05)，TT组大鼠的足围自造模后第28天起至实验结束较AA组有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 知母总皂苷对AA模型大鼠足肿胀度的影响

注：与空白组比较:##P<0.01；与模型组比较:**P<0.01

表3 知母总皂苷对AA模型大鼠足围的影响

注：与空白组比较:##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01

3.2 知母总皂苷对模型大鼠病理形态学影响

图1表4显示，NG组踝关节滑膜正常，未见明显病理改变，AA组大鼠滑膜组织炎性细胞浸润严重，滑膜细胞增生较明显。药物干预后，大鼠滑膜炎性细胞浸润与滑膜细胞增生均明显减轻(P<0.05)。

注：a.空白组；b.模型组；c.阳性组；d.知母总皂苷组；s.滑膜细胞增生，i.炎性细胞浸润图1 大鼠踝关节病理变化(HE，20×10)

表4 知母总皂苷对AA模型踝关节病理的影响比较(分)

3.3 知母总皂苷对模型大鼠血清IL-1β水平的影响

表5显示，AA组血清IL-1β水平显着高于NG组(P<0.01)。与AA组比较，TT组大鼠血清IL-1β水平明显降低(P<0.05)。

表5 知母总皂苷对大鼠血清IL-1β含量及滑膜组织琥珀酸、富马酸含量、SDH酶活性的影响

注：与空白组比较:#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01(n代表例数)

3.4 知母总皂苷对滑膜组织琥珀酸堆积影响

表5显示，与NG组比较，AA组滑膜组织中琥珀酸含量明显升高(P<0.05)。与AA组比较，TT组滑膜组织中琥珀酸积累被显著抑制(P<0.05)。

3.5 知母总皂苷对滑膜组织SDH酶活性及富马酸含量的影响

表5显示，与NG组比较，AA组滑膜样本中的富马酸含量明显降低(P<0.05)，SDH酶活性虽有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与AA组比较，TT组滑膜样本中SDH酶活性及富马酸含量均有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

3.6 知母总皂苷对滑膜组织GPR91蛋白表达的影响

图2显示，与NG组比较，AA组滑膜样本中GPR91蛋白表达显著增强(P<0.05)。与AA组比较，TT组GPR91蛋白水平明显降低(P<0.05)。

注：与空白组比较:#P<0.05；与模型组比较:*P<0.05。a.空白组；b.模型组；c.阳性组；d.知母总皂苷组。棕黄色代表GPR91，蓝色代表细胞核。图2 知母总皂苷对大鼠滑膜组织琥珀酸含量及GPR91表达的影响(10×10)

4 讨论

AA动物模型的病理特征和RA的临床表现在关节肿胀、滑膜炎症、炎性细胞浸润等方面具有高度相似性，且造模方法简单有效[11]。模型大鼠足肿胀程度和关节滑膜病理形态学的改变，可以反映药物的疗效和作用强度，因此常用于药物有效性评价和药物筛选。我们研究发现，知母总皂苷不仅可以拮抗CFA所致的模型大鼠足肿胀和足围异常增大，而且可以改善关节滑膜细胞增生和炎性细胞浸润，提示知母总皂苷具有改善AA模型大鼠滑膜免疫性炎症的作用。现代研究发现，关节局部琥珀酸异常堆积参与了RA的发病进程。具体表现为首先胞外琥珀酸与其受体GPR91的结合，引发炎症级联反应，释放如IL-1β、NO、PG等多种炎性介质，启动或加剧关节滑膜的炎症反应[6]；同时血管生成异常增加促使外周白细胞向关节滑膜的趋向迁移和黏附，加剧滑膜炎性细胞浸润[12]。我们研究发现，知母总皂苷可以显著减少模型大鼠滑膜琥珀酸堆积。GPR91是琥珀酸的特异性细胞膜受体，并且在多种炎性免疫相关细胞中表达，包括巨噬细胞、树突状细胞(也称DC细胞)和FLS，参与后续炎症反应[13]。琥珀酸可增强DC细胞的迁移和抗原提呈能力，GPR91敲除后该作用消失[13]。琥珀酸激活巨噬细胞GPR91受体可导致IL-1β释放，GPR91激活后可以活化胞内钙离子信号通路和蛋白激酶C，导致下游多条炎症信号途径的激活，促使多种炎症介质的释放而放大炎症效应[15]，因此目前GPR91被认为是治疗RA的一个潜在靶标[14]。我们研究发现，AA模型大鼠关节滑膜GPR91蛋白显著高表达，外周血清IL-1β含量显著增高，经知母总皂苷干预后GPR91蛋白表达显著降低，外周血清IL-1β水平显著降低。综上，知母总皂苷拮抗类风湿关节炎作用与抑制琥珀酸/GPR91/IL-1β信号途径有关，但对琥珀酸代谢影响不明显，具体机制有待进一步研究。