基于28S rDNA的南海刺长腹剑水蚤(Oithona setigera)种群遗传多样性研究

季莹莹徐磊黎红王亮根杜飞雁



基于28S rDNA的南海刺长腹剑水蚤()种群遗传多样性研究

季莹莹1,2, 徐磊2, 黎红2, 王亮根2, 杜飞雁2

1. 上海海洋大学海洋科学学院, 上海 201306; 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 广东省渔业生态环境重点实验室, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东 广州 510300

长腹剑水蚤属是海洋中小型浮游动物中最为丰富的类群之一, 在生物地理学与海洋生态学研究中均具有重要地位。本研究基于28S rDNA分析了南海长腹剑水蚤属中较为常见的刺长腹剑水蚤的单倍型多样性和种群遗传结构。结果显示, 792bp长度的核苷酸片段中, 碱基G+C的平均含量为58.2%, 高于A+T含量(41.8%)。种群平均遗传距离ST为0.011。在22个种群共计186个个体中, 发现了28个单倍型, 其中单倍型H10在21个种群中均被发现, 最远距离超过1000km, 说明刺长腹剑水蚤可以实现远距离的扩散且受到南海海流影响。Mantel检验结果显示, 刺长腹剑水蚤种群遗传距离和地理距离无线性相关性(=–0.04615,=0.678); RDA变差分解结果显示, 空间变量全模型对种群遗传结构的解释率为53.3%, 结合种群平均遗传距离ST为0.011, 我们判断目前观测到的刺长腹剑水蚤的种群遗传结构可能由历史上种群扩展带来的拓殖隔离造成。

刺长腹剑水蚤; 28S rDNA; 南海; 遗传分化; 空间隔离

相对于陆地生物, 海洋生物通常被认为没有明显的地理分化。然而, 大量研究证明, 尽管海洋生境间具有较高的连通性, 且海洋生物具有较强的主动与被动扩散的能力, 但种群间的遗传结构依旧存在明显的分化。海洋生物种群遗传结构总体呈现出适中的遗传分化与强基因流相结合的特点(Ward et al, 1994; Baus et al, 2005; Haye et al, 2014; Ellis et al, 2017)。

浮游动物是经常在水中浮游, 自身没有游泳能力或游泳能力微弱的水生生物。浮游桡足类是浮游动物的重要组成部分, 不但在海洋浮游动物的种类数和丰度中都占有很大的比例, 而且在海洋食物网的能量流动与物质循环中处于关键地位(Nakamura et al, 1997; 徐兆礼, 2006; 张武昌等, 2010)。长腹剑水蚤属()属于甲壳动物亚门(Crustacea)颚足纲(Maxillopoda)桡足亚纲(Copepoda)剑水蚤目(Cyclopidea)长腹剑水蚤科(Oithonidae)。长腹剑水蚤在海洋中小型桡足类中占比很大, 在海洋生态系统中占据重要地位(刘光兴等, 2007), 是很多海洋仔稚鱼开口饵料的重要组成部分(Ajiboye et al, 2011; 张才学等, 2011)。长腹剑水蚤在我国海域分布较为广泛, 而刺长腹剑水蚤()是长腹剑水蚤中较为常见的种类之一, 在南海常于春、夏季出现, 且夏季出现频率明显高于春季(Wang et al, 2017)。

南海位于中国大陆的南方, 是太平洋西部的海域, 地处东亚季风区, 海域内拥有稳定而强大的季风。南海面积约3.8×106km2, 多岛屿, 海底的地形复杂, 既包含有大陆架、大陆坡又包含深海盆地等, 同时呈现半封闭状态。南海独特的地理特征以及多时空尺度大气系统的共同作用决定了南海环流形式复杂多变(朱伟军等, 1997; 杨海军等, 1998)。南海独特的水域环境也导致其海域内的长腹剑水蚤具有耐高温高盐的特性, 数量季节变动和种类季节更替比其他海域稳定(李纯厚等, 2004; 孙柔鑫等, 2014; 王兴霞等, 2018)。杜飞雁等(2016)通过对长腹剑水蚤与环境因子的GAM模型(Generalized Additive Models)分析指出南沙海域长腹剑水蚤的数量分布与东西部沿岸流相关。

由于长腹剑水蚤属体型微小, 形态差异细微, 所以对基于生理特征为主的分类鉴定造成较大困难。近年来分子生物学发展迅猛, 尤其是分子标记的成熟, 为浮游桡足类各方向研究提供了新的工具。借助分子生物学的技术不仅可以为桡足类的种类鉴定提供有效方法, 而且可以基于分子水平探讨种群遗传结构, 有效解释物种形成、种群遗传分化、种群的补充机制等重要生态学问题(林元烧, 2005; 刘光兴等, 2007; 王敏晓, 2010)。目前桡足类中广泛应用的分子标记主要有COI、16S rDNA、18S rDNA等, 28S rDNA则被认为进化速度较慢所以较少使用。28S rDNA是核基因的一种, 在鱼类、昆虫类研究中属于广泛使用的分子标记之一, 可以作为研究种群结构和分析系统发育的有效手段(赵静等, 2014)。相对于其他分子标记, 28S rDNA优点在于其在生物体内含量较大, 获取率高, 生物学信息丰富。本研究分析了南海海域刺长腹剑水蚤的单倍型多样性、遗传分化及其可能机制, 旨在利用28S rDNA序列, 了解刺长腹剑水蚤的种群分化规律, 为全面深入开展浮游生物多样性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验样品于2016年10月至2017年9月间采自南海的不同海域, 共计22个站位(图1)。使用网目大小为0.077mm的小型浮游生物网, 由底至表垂直采集水深0~200m范围内浮游动物, 滤去海水, 用蒸馏水淋洗两遍后沥干水分, 用70%乙醇固定。

图1 采样站位分布示意图

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

返回实验室后, 将样品转移至95%乙醇中并在4℃环境下保存。参照《中国海浮游桡足类图谱》(张武昌等, 2010), 在解剖镜下根据体长、第三胸足以及生殖节的形态, 选取个体表面清洁的成体刺长腹剑水蚤, 共计186只, 具体采样站位及样品信息见表1。

1.2.2 样品DNA提取

将每个样品用蒸馏水润洗后单独放入到加有80μL磷酸缓冲液的破碎管中, 加入破碎珠后放于破碎仪(Tissue Cell-Destroyer)内进行充分的震荡破碎, 然后使用DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒(QIAGEN, 德国)提取DNA, 具体过程参照试剂盒说明书步骤进行。提取的DNA于–20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增与测序

采用通用引物对28S rDNA基因进行PCR扩增, 引物分别为28SF(5′GCG GAG GAA AAG AAA CTA AC3′)和28SR1(5′-GCA TAG TTT CAC CAT CTT TCG GG-3′)(Costa et al, 2007)。PCR扩增体系为20μL, 包含13.25μL ddH2O, 2μL的10× Ex Taq Buffer(Mg2+plus), 1.6μL的dNTP Mixture, 0.15μL TaKaRa Ex Taq(5 U·μL–1), 1μL的引物和1μL的DNA 模板。PCR反应条件为: 95℃预变性2min, 94℃变性25s, 51℃退火25s, 72℃延伸30s, 共10个循环; 94℃变性20s, 49℃退火25s, 72℃延伸30s, 共10个循环; 94℃变性20s, 48℃退火25s, 72℃延伸35s, 共8个循环, 最后18℃充分延伸30min, 于10℃保存。通过琼脂凝胶电泳检测, 选取条带亮度正常的PCR产物送天一辉远(广州)纯化并进行双向测序。

表1 刺长腹剑水蚤(Oithona setigera)种群采集站点及其基本信息

注: NaN为无数据

1.3 数据处理

首先将测序获得的原始数据在NCBI数据库中进行同源性比对以确保获取的是目的基因。然后利用BioEdit (Hall, 1999)软件删除每条序列两端不对齐的部分。之后利用DNASP 5.10(Rozas et al, 2003)软件统计单倍型多样性及核酸多样性等。用MEGA6.0(Kumar et al, 2008)软件计算碱基组成、差异和个体间遗传距离。用MEGA6.0软件中Kimura 2-parameter模型计算28S rDNA基因序列遗传差异度, 变异估算方法选择自举法(bootstrapping method), 运行次数设定为1000次, 序列间位点选择相同进化率, 同时删除缺失位点。为了更加直观的探讨刺长腹剑水蚤的单倍型之间的进化关系, 我们通过HAPLOVIEWER绘制了单倍型网络图(Salzburger et al, 2011; 黄琦等, 2017)。Mantel检验可以用来衡量遗传距离和环境变量之间的关系(薛亚东等, 2011),所以我们使用MEGA6.0计算种群遗传距离ST, 通过取样点的经纬度确定地理距离, 然后利用R程序中的Vegan软件包将获得的空间距离和遗传距离进行mantel检验(范启等, 2014)。冗余分析(redundancy analysis, RDA)能够独立保持各个环境变量对生物群落变化的贡献率, 反映环境因子对群落产生的影响(田志富, 2012)。MEM (Moran’s Eigenvector Map analysis)模型是基于各点之间实际距离的一种空间变量分析模型(Izzard et al, 2006), 可用于计算空间特征向量, 反映空间结构。在本研究中我们采用MEM模型来模拟刺长腹剑水蚤通过空间被动迁移或海流主导进行扩散的途径, 再结合采集的各个站位的环境数据(叶绿素浓度、海水表面温度、盐度、风速)进行冗余变差分析, 保留了≦0.05的显著因子, 以求进一步了解环境和空间变量对刺长腹剑水蚤种群遗传结构的影响。

2 结果与分析

2.1 单倍型多样性

通过PCR获得186条28S rDNA基因序列, 经过测序、比对校正后除去重复区得到序列长度为792bp。核苷酸组成中C: 25.6%, G: 32.6%, A: 20.6%, T: 21.2%, 其中C+G含量(58.2%)高于A+T含量(41.8%), 符合核基因组碱基组成的特点。平均转换颠换(si/sv)数为1.16。基因序列比对结果显示序列可识别位点(不包括缺失与丟失的位点)774个, 其中保守位点689个, 变异位点95个, 单一位点23个, 简约信息位点62个。186条28S rDNA基因序列共计22个种群, 定义了28个单倍型, 单倍型多样性(Hd)为0.632, 基因多态位点(S)为85。单倍型网络图(图2)中显示在这28个单倍型中, 有10个单倍型(H7、H8、H10、H15、H17、H21、H22、H23、H25、H26)在一个以上的采样点被观测到, 其中单倍型H10作为主要单倍型, 出现次数最多, 在21个采样点中均被发现。5个单倍型(H7、H21、H22、H25、H26)由两个采样点共享。

图2 单倍型网络图S1—S22为站位编号; H1—H28为单倍型编号

2.2 种群遗传分化

所有样本平均核苷酸变异数()为8.131, 核酸多样性(P)为0.01051, 种群平均遗传距离ST为1.1%, 遗传差异度为0.0216%~4.3612%。从遗传距离和地理距离看, S5和S21之间的遗传距离最远为4.3612%, 它们之间的地理距离是538.86km; S8和S11之间的遗传距离最近为0.0216%, 它们之间的地理距离是247.92km; 地理距离最远的S14和S22为1163.00km, 他们之间的遗传距离为0.6992%; 地理距离最近的S1和S22为48.64km, 它们之间的遗传距离为0.324%, 种群遗传距离和地理距离之间没有表现出相关性(表2、表3)。这与本研究中Mantel检验结果相同(Mantel检验=–0.04615,=0.678)(图3)。

表2 部分站位之间刺长腹剑水蚤(Oithona setigera)的遗传距离(%)

注: 由于数据量大, 故只展示部分显著性较强的数据

表3 部分站位之间刺长腹剑水蚤(Oithona setigera)的空间距离(km)

注: 由于数据量大, 故只展示部分显著性较强的数据

图3 种群遗传距离与空间距离间的相关性

本研究对象的RDA分析显示(表4), 空间变量全模型对遗传结构的解释为63.8%, 有4个大尺度的空间莫兰特征向量(<0.05)被选中; 纳入环境变量后, 单纯空间变量对遗传结构的解释率为53.3%。环境变量全模型对遗传结构的解释为14.1%, 其中风速是最显著的影响(=0.048); 纳入空间变量后, 单纯环境变量对遗传结构的解释率为7.7%。环境变量和空间变量共同对遗传结构的解释为61.1%, 不能解释的部分为38.9%。

表4 空间变量与环境变量的RDA变差分解结果

Tab. 4 The redundancy analysis results of spatial variables and environmental variables

3 讨论

相对于陆地生物, 海洋生境之中缺乏明显的物理屏障, 使得海洋生物种群之间的连通性高, 能在“开放”的海域进行基因交流。另外, 海洋生物的一些生物学特性也削弱了种群的分化, 例如具有较大的种群数量和较强的繁殖能力削弱了小种群遗传漂变的可能; 种群广泛的分布范围和成体或幼体阶段较强的扩散能力等加强了种群间的基因流(Palumbi, 1994; Nielsen et al, 2001; Luttikhuizen et al, 2003; Kenchington et al, 2006)。个体扩散对种群遗传结构的影响在海洋生境中被进一步放大, 所以具有良好传播能力的海洋生物通常被认为很少或根本没有遗传结构(Palumbi, 1994)。但是, 还是有很多研究表明, 在较大的空间范围里, 种群间尽管表现出潜在较高水平的主动或被动扩散能力, 可实际上真实存在的基因流水平往往并不高(Goetze, 2003)。Taylor等(2006)通过研究加勒比海附近的虾虎鱼的浮游生活期发现, 虽然虾虎仔鱼会经历长时间的浮游, 但其群体之间仍然存在着显著的遗传分化。此外大量研究也表明众多的海洋浮游动物中都存在隐种, Cornils等(2017)通过对全球不同海域的拟长腹剑水蚤的COI基因进行单倍型分析后认为拟长腹剑水蚤并不属于全球性广布种类, 且存在大量隐种分化, 其物种形成也比想象中的要快(Chen, 2006)。

海洋生物种群之间基因流的扩散受到了多种原因的限制。例如历史事件(海平面变化), 环境选择(温度、盐度), 距离隔离(扩散限制)等(Hilbish et al, 1985; Gilg et al, 2003)。Palumbi(1994)认为海洋中的基因流可能会受海洋中复杂环流的引导或者限制。体型较小的海洋生物幼虫和游泳能力较弱的浮游动物的扩散范围在一定程度上取决于其生存环境周围的洋流长度(Waple, 1998)。同样的, 洋流的存在会使海洋变成不连续的栖息地, 成为基因流动的障碍(曲若竹等, 2004)。除洋流外, 种群的生活史、水温、风速等也都可能对高传播潜力的物种产生限制, 虽然这种限制不一定会给基因流带来绝对的阻碍, 但也可能会影响基因流的方向或时间(Weersing et al,2009)。浮游桡足类的扩散模式不仅与其生活史, 个体对各种环境因子的耐受能力高低等生物学过程有关, 还与物理时间例如海底阻隔、海流结构及其运动模式、水体温度、盐度跃层动态等有着密切关联(林元烧, 2005)。

本研究利用28S rDNA分析南海刺长腹剑水蚤的遗传多样性, 根据mantel检验的结果显示, 刺长腹剑水蚤的种群遗传距离与地理距离没有呈现相关性(=–0.04615,=0.678)。地理距离相距较近的种群之间存在较大的遗传分化, 而有的遗传分化较低的种群之间却在地理距离上相距甚远。RDA 结果显示空间变量全模型对遗传结构的解释为63.8%, 有4个大尺度的空间莫兰特征向量(<0.05)被选中。结合RDA和Mantel检验结果来看, 有空间变量对刺长腹剑水蚤的种群遗传结构产生影响, 但其遗传结构并没有与现实的地理距离远近之间产生相关, 所以造成现有刺长腹剑水蚤种群结构的主要原因可能是由于历史上的种群扩展带来的拓殖隔离(isolation-by- colonization)。虽然海洋生境中缺乏明显的物理障碍, 但是海洋生物种群间的基因流仍然受到很大的限制, 所以某些特殊历史事件就会在种群分化与物种形成的过程中起着至关重要的作用(Baratti et al, 2005, Horne et al, 2008, Castelin et al, 2013)。早期时段刺长腹剑水蚤被动扩散, 依靠幼虫具有的各种感觉结构迅速适应环境, 在某些特定水团中维持自身生存的稳定。后来由于洋流、黑潮等阻隔了部分区域间的基因流动, 刺长腹剑水蚤种群间由此产生了遗传结构的改变。本研究中22个种群中共发现了28个单倍型, 其中分布范围最广的单倍型H10在除S22外的其他种群中均被发现, 所以它极有可能就是种群拓殖隔离的过程中作为祖先单倍型被保留了下来, 刺长腹剑水蚤的种群遗传结构可能在早期就已经形, 很少受现实的基因流影响。

南海刺长腹剑水蚤22个种群定义的28个单倍型中有18个单倍型为独有单倍型, 可见种群间单倍型组成表现出了一定的分化。从单倍型的空间分布来看, 单倍型H10在21个采样站中均被发现, 之间最远距离相隔了1000km以上, 扩散距离几乎包含从南海南部至南海北部的所有采样范围, 说明刺长腹剑水蚤可以实现远距离扩散。我们虽然无法直接测定造成刺长腹剑水蚤远距离扩散的具体载体, 但是大量有关种群遗传结构分化的研究中均证实海流对海洋生物物种的形成具有重要影响(White et al, 2010)。再结合本研究RDA分析中环境的全模型结果, 显示风速对刺长腹剑水蚤遗传结构产生了显著影响, 而南海海域受季风影响强烈, 该海域上层主要的4支海流中除东部沿岸流外其他3支主要流系的流向均随季风风向改变, 且长腹剑水蚤属数量分布的季节变化与季风驱动的沿岸流势力强弱密切相关。所以综合来看, 我们认为是南海季节性的海流变化造成了游泳能力较弱的刺长腹剑水蚤种群的复杂分布状况。

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Genetic structure offrom South China Sea based on 28S rDNA gene

JI Yingying1, 2, XU Lei2, LI Hong2, WANG Lianggen2, DU Feiyan2

1. College of Marine Sciences, Shanghai ocean university, Shanghai 201306, China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment, Guangzhou 510300, China

is one of the most abundant species of small and medium zooplankton in the ocean, and plays an important role in marine biogeographic genetics and ecology research. In this study, we employed 28S rDNA to analyze the population genetic structure and haplotype pattern of the most common species () in the South China Sea. A dataset of 792 bp in length sequences was obtained. The average contents of G+C (58.2%) were significantly higher than those of A+T (41.8%) in the fragment. Atotal of 28 haplotypes were defined from 186 individuals, of which the dominant haplotype H10 was found in 21 populations. The largest distance between two sampling sites harboring this haplotype is more than 1000 km, indicatingcan achieve long distancedisperse and be affected by ocean currents.The Mantel test showed that there was no linear correlation between the genetic distance and geographical distance (= –0.04615,=0.678); the RDA (redundancy analysis) results indicated space factor significantly affect the population genetic structure rather than environmental factors. The population genetic structure ofmay be caused by colonization events followed by demographic expansions.

; 28S rDNA; South China Sea; geneticdifferentiation; isolation-by-distance

Q179.1

A

1009-5470(2019)03-0089-9

10.11978/2018112

2018-10-25;

2018-12-20。林强编辑

国家自然科学基金(41406188); 中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2017YB26、2016TS24)

季莹莹(1994—), 女, 江苏省南京市人, 硕士研究生, E-mail: 15705117350@163.com

杜飞雁(1974—), 研究员, 主要研究方向为海洋生态学研究。E-mail:feiyanegg@163.com

2018-10-25;

2018-12-20. Editor: LIN Qiang

National Natural Science Foundation of China(41406188); South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes (2017YB26, 2016TS24)

DU Feiyan, E-mail:feiyanegg@163.com