群体感应抑制活性导向分离腐皮镰刀菌中代谢产物

季宇彬, 张哲, 张伟浩, 王虎 , 潘英, 姜薇,



群体感应抑制活性导向分离腐皮镰刀菌中代谢产物

季宇彬1, 张哲1, 张伟浩2, 王虎2, 潘英3, 姜薇1, 2

1. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心, 黑龙江 哈尔滨 150076; 2. 扬州大学环境科学与工程学院,江苏 扬州 225127; 3. 江苏省肿瘤医院, 江苏 南京 210009

本实验采用群体感应抑制(quorum sensing inhibitory,QSI)活性导向法, 对分离自山东威海近海底泥的真菌WH7-2开展代谢产物研究。综合菌落形态和转录间隔区 (Internal Transcribed Spacer, ITS)全序列分析, 菌株WH7-2鉴定为腐皮镰刀菌。综合运用多种色谱方法, 从该真菌大米发酵产物的活性部位中分离得到11个化合物。分别鉴定为(2, 5)-3, 5, 7-三甲基-2, 5-辛二烯酸(1)、不饱和脂肪酸酯混合物 (2—4)、镰红菌素-3-甲醚(5)、脱水镰红菌素(6)、(22)-5, 8-过氧化麦角甾-6, 22-二烯-3-醇(7)、(22)-5, 8-过氧化麦角甾-6, 9 (11), 22-三烯-3-醇(8)、3-羟基-胆甾-5-烯-7-酮 (9)、6-羟基-胆甾-4-烯-3-酮(10)和(22)-胆甾-5, 22-二烯-3-醇 (11)。其中不饱和脂肪酸酯混合物(2—4)具有QSI活性, 其他化合物无QSI活性。除5和6外, 其他化合物均为首次从腐皮镰刀菌中发现。

群体感应抑制活性; 腐皮镰刀菌; 不饱和脂肪酸酯; 甾体; 镰红菌素

镰刀菌属于子囊菌门丝藻纲肉座菌目镰刀属, 是广泛分布在土壤和植物体内的一类丝状真菌, 喜好寄生或腐生, 其中许多菌种为植物致病真菌。腐皮镰刀菌()寄生植物时(如玉米和小麦等农作物), 通常会导致寄生植物致病。但对于某些植物而言, 却是互利共生关系, 例如腐皮镰刀菌可以诱导健康的白木香产生沉香(李雯珊, 2016)。对腐皮镰刀菌的研究发现, 其主要代谢产物结构类型包括黄酮(李雯珊, 2016)、醌(Tatum et al, 1985, 1987; Tadpetch et al, 2015; 宋双等, 2015)、吡喃酮(Trisuwan et al, 2013)、环肽(Song, 2011)、苯衍生物(Tadpetch et al, 2015; Shiono et al, 2016)、多糖(Mahapatraet al, 2012)等, 其中醌类里的镰红菌素类化合物是腐皮镰刀菌的特征次生代谢产物(宋双等, 2015)。

群体感应(quorum sensing, QS)是细菌之间利用自诱导物作为信号分子进行信息交流, 然后再依据外界的环境变化, 作出相应的生理活动, 或作为病原菌感染宿主的一种细菌群体行为调控机制, QS涉及细菌诸多生理功能, 如毒性因子的释放、胞外多糖的合成和分泌、细菌生物膜的形成等 (Whiteley et al, 2017)。传统抗生素对浮游菌和表层菌效果显著, 但较难清除可形成生物膜的细菌。群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitory, QSI)可以通过抑制致病菌群的QS效应达到治疗目的, 这为抗菌药物的研发提供了新思路。紫色杆菌()能够产生紫色杆菌素, 并受到高丝氨酸内酯类化合物的调节(QS信号分子)。若测试样品具有QSI活性, 而不具有其他抑菌作用, 则不能产生紫色素, 但可以正常生长, 在琼脂板培养基上样品周围表现出有菌生长, 但不产紫色色素的抑制圈(Martinelli et al, 2004)。因此可用作QSI活性筛选的指示菌。

前期对分离自山东威海附近海域的近海底泥真菌进行了QSI活性筛选, 发现菌株WH7-2发酵产物QSI活性呈阳性。本实验采用QSI活性导向法, 对该菌株的次生代谢产物开展研究, 并报道了该菌株的种属鉴定、化合物提取分离、结构鉴定及QSI活性测试结果。

1 材料和方法

1.1 材料

主要仪器与试剂: Bruker AV-600型核磁共振仪测定1维 (1D)和2维 (2D)核磁共振数据; 分析型液相色谱仪为HITACHI L-2000配L-2455 DAD检测器, 色谱柱为ApolloRP-18 (5µm, 4.6mm´250mm);半制备高效液相色谱仪为LabTech LC600配UV600紫外检测器, 色谱柱用Kromasil RP-18 (10mm´250mm); Thermo Scientific ITQ 900气相-质谱联用仪, TR-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm), 离子阱检测器, 高纯氦为载气, Nist08谱库; 上海新科318-MC高速双波长酶标仪; 阿拉丁硅胶(200~300目); YMC的ODS (50µm); 青岛海洋化工薄层色谱硅胶板(GF254); 国药集团化学试剂有限公司的分析级和色谱级甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚。

菌株来源: 真菌WH7-2菌株分离自山东威海附近海域的近海底泥(采样时间为2015年10月), 前期QSI筛选显阳性, 标本现存放于扬州大学海洋科学与技术研究所。

1.2 菌株培养与规模化发酵

从–80℃超低温冰箱中取出保种的菌株, 放置至室温, 夹出含有菌丝的菌块, 贴放于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA)(土豆200g·L–1, 葡萄糖20g·L–1、海盐30g·L–1和琼脂18g·L–1)上, 28℃倒置培养3~5d, 获得纯菌落。250mL锥形瓶中装入100mL的PDB液体培养基, 1×105Pa灭菌20min, 接种适量复苏好的菌落, 28℃, 120r·min–1振荡培养3d, 获得种子液。规模化发酵采用大米培养基(1000mL锥形瓶中装入40g大米和盐度为3%的人工海水溶液80mL, 1×105Pa灭菌20min), 每瓶接10mL种子液, 接种50瓶, 28℃, 静置培养40d。

1.3 菌种鉴定

在PDA固体培养基上, 该菌株生长较为缓慢, 菌落正面呈白色, 质地絮状, 菌丝体短。测定菌的ITS序列(上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析), 鉴定菌株WH7-2为。

1.4 QSI活性测试

测试菌种: 紫色杆菌(12472)。

LB培养基: 酵母膏5.0g·L–1, 胰蛋白胨10.0g·L–1, NaCl浓度为10.0g·L–1。

取紫色杆菌于LB液体培养基中, 28℃, 120r·min–1振荡培养2d, 备用。将灭菌后的LB固体培养基倒入培养皿中(直径为90mm), 移取已培养好的菌液加入平皿中, 用涂布器将菌液涂布均匀, 用甲醇将样品配制成一定浓度的溶液, 吸取3μL滴加到直径为6mm滤纸片上, 挥干溶剂, 将加药面贴服于培养基上, 每个样品做两组平行, 将贴好滤纸片的培养皿封口后置于28℃恒温培养箱中倒置培养18~24h, 测量模糊圈直径。

1.5 QSI活性导向分离

用乙酸乙酯浸泡大米发酵产物, 提取3次, 过滤, 收集乙酸乙酯, 减压浓缩得粗提物30g。浸膏经硅胶减压柱色谱, 石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱, 得到19个组分Fr.1-19。其中石油醚׃乙酸乙酯=40:1至30:1洗脱下的组分(Fr.9)具有QSI活性, 滤纸片加样量为每片500μg时, 模糊圈直径达10mm。Fr.9 (700mg)经ODS减压柱, 甲醇/水系统梯度洗脱, 得到6个组分(Fr.9-1至9-6)。其中Fr.9-4(甲醇׃水=65:35至80׃20洗脱)和Fr.9-5(甲醇׃水=80׃20至95׃5洗脱)在滤纸片加样量为每片500μg时, 有QSI活性, 模糊圈直径分别为12和7mm。Fr.9-4 (130mg)经半制备高效液相色谱 (high performance liquid chromatography, HPLC)纯化(流速1.5mL·min–1, 检测波长210nm), 流动相为甲醇׃水=55׃45得化合物1 (25.0mg); 流动相为乙腈׃水=70׃30得不饱和脂肪酸混合物(2, 3和4)(31.2mg)、5 (4.8mg)、6 (4.0mg)。Fr.9-5 (225.0mg)经半制备HPLC纯化(流速1.5mL·min–1, 检测波长210nm), 流动相为乙腈׃水=90׃10得到化合物7 (17.0mg)、8 (6.6mg)、9和10混合物(13.4mg)、11(5.2mg)。

2 结果

2.1 化合物的结构鉴定

化合物1为无色油状, 二氯甲烷和甲醇均可溶。HRESI-MS给出准分子离子235.09470 [M+Na]+(计算值为235.09463), 确定其分子式为C11H16O4, 不饱和度为4。1H NMR中存在2个烯质子H5.29 (1H,d,= 9.2 Hz, H-6)和5.73 (1H, s, H-2), 1个与H-6相互偶合的次甲基质子H3.39 (1H,dq,= 9.2, 7.0Hz, H-7);H2.84 (2H, s, H-4)提示该亚甲基可能位于两个独立双键的中间, 除此之外, 高场区还有2个单峰甲基信号和1个双峰甲基信号。13C NMR显示两个羧酸或者酯羰基碳信号C181.4 (s, C-8) 和172.2 (s, C-1)。HMBC显示H1.28 (3H, d,= 7.5Hz, H-11)与C-8 (181.4, s)和C-6 (127.5, d)相关,H1.63 (3H, s, H-10)与C-6 (127.5, d)和C-4 (51.2, t )相关,H2.10 (3H, s, H-9)与C-2 (116.9, d)和C-4 (51.2, t)相关, 从而建立起化合物1的平面结构(图1)。NOESY谱中可见H-2/H-6相关, 提示结构中的两个双键均为E构型。结构鉴定为(2, 5)-3,5,7-trimethylocta-2,5-dienedioic acid。化合物1的1H -NMR(600 MHz, CDCl3):H5.73 (1H, s, H-2), 5.29 (1H,d,= 9.2 Hz, H-6),3.39 (1H,dq,= 9.2, 7.0 Hz, H-7), 2.84 (2H, s, H-4), 2.10 (3H, s, H-9), 1.63 (3H, s, H-10), 1.28 (3H, d,= 7.0 Hz, H-11);13C-NMR (150 MHz, CDCl3):C181.4 (s, C-8), 172.2 (s, C-1), 160.8 (s, C-3), 134.3 (s, C-5), 127.5 (d, C-6), 116.9 (d, C-2), 51.2 (t, C-4), 39.0 (d, C-7), 18.6 (q, C-11), 17.8 (q, C-9), 16.2 (q, C-10)。化合物1为一个新天然产物, 并首次报道其核磁数据。

化合物2, 3和4的混合物为无色油状, 易溶于氯仿, 可溶于甲醇。1H NMR中H5.30~6.50呈多组烯质子信号,H1.20~2.50为亚甲基质子,H3.67~4.10为连氧的甲基或亚甲基质子,H0.87~0.89为甲基质子, 初步分析为不饱和脂肪酸酯。进一步通过GC-MS分析。色谱条件如下: 程序升温, 初始温度为60℃, 保留1min, 以15℃·min–1升至250℃, 保留5min, 再以5℃·min–1升至280℃, 保留5min; TR-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm), 进样口温度为280℃, 气化室温度为270℃, 载气为氦气, 分流比为5:1。质谱条件: 离子源为电子轰击, 离子源温度250℃, 轰击电子能量70eV; 质量分析器为四级杆离子阱, 质量扫描范围50~650amu。色谱图显示3个保留时间分别为22.4、23.1和24.5min的色谱峰, 经Nist08谱库检索, 均为不饱和脂肪酸酯(结果见表1, 结构见图1)。

表1 化合物2、3和4的GC-MS分析结果

化合物5为红色粉末, 氯仿易溶, 甲醇可溶。ESI-MS343 [M+Na]+。1D 和2D NMR解析并比对文献 (郁步竹等, 2009), 确定化合物5为3-methyl ether fusarubin(图1)。化合物5的1H (600MHz, CDCl3):H12.90 (1H, br.s, 10-OH), 12.70 (1H,br.s, 5-OH), 6.18 (1H,s, H-8), 4.88 (1H, dd,= 17.8, 1.4 Hz, H-1a), 4.57 (1H, dd,= 17.8, 1.4 Hz, H-1b), 3.93 (3H, s, 7-OCH3), 3.32 (3H, s, 3-OCH3), 3.02 (1H, dd,= 18.0, 1.4 Hz, H-4a), 2.67 (1H, dd,= 18.0, 1.4 Hz, H-4b), 1.55 (3H, s, 3-CH3);13C NMR (150MHz, CDCl3):C185.0 (s, C-9), 178.4 (s, C-6), 160.9 (s, C-7), 160.8 (s, C-5), 157.4 (s, C-10), 137.3 (s, C-10a), 133.0 (s, C-4a), 109.9 (s, C-5a), 109.8 (d, C-8), 107.7 (s, C-9a), 97.0 (s, C-3), 58.8 (t, C-1), 56.9 (q, C-7-OCH3), 49.1 (q, C-3-OCH3), 33.1 (t, C-4), 23.0 (q, C-3-CH3)。

化合物6为紫色粉末, 氯仿易溶, 甲醇可溶。ESI-MS289 [M+H]+。1H NMR和化合物5较为相似, 化合物6中少了1个甲氧基和1组亚甲基, 多了1个烯质子。1D 和2D NMR结构解析并比对文献 (郁步竹等, 2009), 确定化合物6为Anhydrofusarubin(图1)。化合物6的1H NMR (600 MHz, CDCl3):H13.10 (1H, br.s, 10-OH), 12.70 (1H,br.s, 5-OH), 6.19 (1H,s, H-8), 6.02 (1H,s, H-4), 5.24 (2H, s,H-1), 3.92 (3H, s, 7-OCH3), 2.02 (3H, s, 3-CH3);13C NMR (150 MHz, CDCl3):C183.2 (s, C-9), 178.2 (s, C-6), 161.7 (s, C-3/7), 160.2 (s, C-5), 157.9.0 (s, C-10), 133.2 (s, C-10a), 122.9 (s, C-4a), 111.1 (s, C-5a), 110.2 (d, C-8), 108.1 (s, C-9a), 94.9 (d, C-4), 63.1 (t, C-1), 56.8 (q, C-7-OCH3), 20.3 (q, C-3-CH3)。

化合物7为白色粉末, 易溶于氯仿, 微溶于甲醇。ESI-MS429 [M+H]+。1H NMR有4个烯质子, 1个羟基取代的次甲基信号, 6个甲基(4个双峰, 2个单峰), 与麦角甾的特征信号吻合。对比吴荣翠等(2013), 化合物7鉴定为 (22)-5,8-epidioxy- ergosta-6, 22-diene-3-ol(图1)。化合物7的1H-NMR (600 MHz, CDCl3):H6.50 (1H,d,= 8.5 Hz, H-7), 6.24 (1H,d,= 8.5 Hz, H-6), 5.21 (1H,dd,= 15.2, 7.5 Hz, H-23), 5.15 (1H,dd,= 15.2, 8.0 Hz, H-22), 3.96 (1H,m, H-3), 1.00 (3H, d,= 6.5 Hz, H-21), 0.91 (3H, d,= 6.8 Hz, H-28), 0.88 (3H, s, H-19), 0.84 (3H, s, H-18), 0.82 (6H, overlap, H-26/27)。

化合物8为白色粉末, 易溶于氯仿, 微溶于甲醇。ESI-MS427 [M+H]+。1H NMR和化合物7非常相似, 化合物8低场区较化合物7多出一个烯质子H5.44 (1H,dd,= 6.0, 1.9 Hz, H-11), 推测结构中多出1个双键。对比吴荣翠等(2013), 化合物8鉴定为(22)-5, 8-epidioxy-ergosta-6, 9 (11), 22-triene-3-ol(图1)。化合物8的1H-NMR (600 MHz, CDCl3):H6.61 (1H,d,= 8.5 Hz, H-7), 6.30 (1H,d,= 8.5 Hz, H-6), 5.44 (1H,dd,= 6.0, 1.9 Hz, H-11), 5.23 (1H,dd,= 15.2, 7.5 Hz, H-23), 5.18 (1H,dd,= 15.2, 8.0 Hz, H-22), 4.03 (1H,m, H-3), 1.11 (3H, s, H-19), 1.02 (3H, d,= 6.5 Hz, H-21), 0.93 (3H, d,= 6.8 Hz, H-28), 0.84 (6H, d,= 6.8 Hz, H-26/27), 0.75 (3H, s, H-18)。

图1. 化合物1—11结构图

化合物9和10为1:1的混合物, 是一组同分异构体。混合物为白色针晶, 易溶于氯仿, 微溶于甲醇。对比文献(刘梨萍等, 2014; 钱西勇等, 2016), 化合物9和10分别鉴定为3-hydroxycholesta-5-en- 7-one和6-hydroxy-cholest-4-en-3-one(图1)。化合物9的1H-NMR (600 MHz, CDCl3):H5.70 (1H,s, H-6), 3.69 (1H,m, H-3), 2.51 (1H,m, H-4a), 2.39 (1H,m, H-4b), 2.23 (1H,t,= 9.6 Hz, H-8), 1.20 (3H, s, H-19), 0.94 (3H, d,=6.5 Hz, H-21), 0.85 (6H, overlap, H-26/27), 0.69 (3H, s, H-18)。化合物10的1H-NMR (600 MHz, CDCl3):H5.83 (1H,s, H-4), 4.37 (1H,s, H-6), 1.39 (3H, s, H-19), 0.95 (3H, d,= 6.5 Hz, H-21), 0.87 (6H, overlap, H-26/27), 0.76 (3H, s, H-18)。

化合物11为白色粉末, 易溶于氯仿, 微溶于甲醇。EI-MS384 [M]+。1H NMR有3个烯质子(其中两个为反式偶合的烯质子), 1个羟基取代的次甲基信号, 5个甲基, 初步推测可能是3-羟基-22烯类型的胆甾。对比刘彩霞等(2012), 化合物11鉴定为(22)-胆甾-5, 22-二烯-3-醇[(22)-cholest-5,22- dien-3-ol](图1)。化合物11的1H (600 MHz, CDCl3):H5.35 (1H,d,= 2.5 Hz, H-6), 5.26 (1H,dt,= 15.5, 7.3 Hz, H-23), 5.21 (1H,dd,= 15.5, 7.6 Hz, H-22), 3.51 (1H,m, H-3), 1.00 (6H, overlap, H-19/21), 0.86 (6H, d,= 6.4 Hz, H-26/27), 0.69 (3H, s, H-18)。

2.2 化合物QSI活性分析

化合物2, 3, 4不饱和脂肪酸酯的混合物在浓度为每片250μg时有QSI活性(模糊圈直径7mm), 其他化合物未发现有QSI活性。

3 讨论

本实验采用QSI活性导向法对真菌WH7-2菌株的大米发酵产物开展研究。从其活性部位Fr.9-4中发现化合物1—6, 其中1—4为脂肪族化合物, 5和6为镰红菌素类化合物。化合物2—4为不饱和脂肪酸酯的混合物, 具有QSI活性。关于QSI的结构, 文献报道中很少涉及脂肪烃(醇/酸/酯)类似物, 但有的细菌里存在脂肪烃(醇/酸/酯)类QS信号分子, 如2-甲基-十二碳烯酸, 羟基棕榈酸甲酯等(Whiteley et al, 2017), 因此发掘脂肪烃(醇/酸/酯)类化合物作为QSI是可行的。从活性部位Fr.9-5中发现5个甾体类化合物(7—11), 结构类型为麦角甾和胆甾, 均为首次从该种中发现。化合物7—11的QSI活性均呈阴性, 对活性组分进行追踪分离, 单体却缺乏活性, 分析原因一方面有可能在分离过程中丢失了其他结构类型的微量活性物质, 另一方面也可能单体物质间存在协同效应。

4 结语

本研究采用QSI活性导向法, 从真菌WH7-2的大米发酵产物分离鉴定了11个化合物, 分别为4个脂肪烃类(酸酯)(1—4)、2个镰红菌素类(5—6)和5个甾体类(7—11)。脂肪酸酯的混合物(2—4)具有QSI活性。5个甾体类化合物均为首次从中发现。本研究扩充了QSI的结构类型, 也丰富了真菌中次生代谢产物的结构多样性。

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WHITELEY M, DIGGLE S P, GREENBERG E P, 2017. Progress in and promise of bacterial quorum sensing research[J]. Nature, 551(7680): 313–320.

QSI activity-oriented isolation of metabolites from

JI Yubin1, ZHANG Zhe1, ZHANG Weihao2, WANG Hu2, PAN Ying3, JIANG Wei1, 2

1. Research Center of Life and Environment Science, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. School of Environmental Science and Engineering, Yangzhou 225127, China; 3. Jiangsu Cancer Hospital, Nanjing 210009, China

In this study, we investigated the metabolites from coastal mud-derived fungus WH7-2 by using the quorum sensing inhibitory (QSI) activity-oriented approach. The strain WH7-2 was identified asby analyzing its morphological characteristics and internal transcribed spacer (ITS) sequence. Chemical investigation of the rice fermentation product led to the isolation of 11 compounds. Their structures were elucidated as (2, 5)-3, 5, 7-trimethyl-2, 5-octadienoic acid (1), mixtures of unsaturated fatty acid ester (2, 3 and 4), 3-methyl ether fusarubin(5),Anhydrofusarubin (6), (22)-5α, 8- epidioxy-ergosta-6, 22-diene-3-ol(7),(22)-5, 8-epidioxy-ergosta-6, 9(11), 22-triene-3-ol (8),3-hydroxycholest-5-en-7-one(9), 6β-hydroxy-cholest-4-en-3-one(10), and (22E)-cholest-5, 22-dien-3β-ol(11).All compounds were evaluated for their QSI activities, and only the mixtures of unsaturated fatty acid ester (2-4) exhibited QSI activity. All the compounds except 5 and 6 were first reported from.

QSI;; unsaturated fatty acid ester; steroid; fusarubin

Q935; R915

A

1009-5470(2019)03-0098-06

10.11978/2018096

2018-09-25;

2018-11-21。林强编辑

江苏省高校自然科学基金(15KJB170020); 浙江省药学重中之重一级学科开放基金(201707); 扬州大学培育基金(2017CXJ050)

季宇彬(1956—), 男, 黑龙江省哈尔滨市人, 博士, 教授, 研究方向: 抗肿瘤药物研究。E-mail: gjyjgy@tom.com

姜薇。E-mail: weijiang@yzu.edu.cn

2018-09-25;

2018-11-21. Editor: LIN Qiang

Natural Science Foundation for College and University of Jiangsu Province (15KJB170020); Opening Project of Zhejiang Provincial Top Key Discipline of Pharmaceutical Sciences (201707); Yangzhou University Incubation Foundation (2017CXJ050)

JIANG Wei. E-mail: weijiang@yzu.edu.cn