HPLC方法同步测定四黄止痢复方中黄芩苷和小檗碱的含量

王 培， 钟文诗， 孙嘉一， 徐子恒， 蒋 红，王宏军

（锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001）

四黄止痢组方源自《中国兽药典》（2015版），由黄芩 （Scutellaria baicalensis Georgi）、 黄柏（Phellodendron chinense Schneid）、 黄 连 （Coptis chinensis Franch）、大 黄 （Rheum offcinale Baill）、甘草 （Glycyrrhiza uralensis Fisch）、板蓝根（Isatis tinctoria L）六味中草药组成，能有效治疗鸡、猪的湿热泻痢，鸡大肠杆菌病等，具有清热泻火、解毒止痢等功效。熊玥等（2015）在四黄止痢颗粒制剂的质量标准研究中仅涉及到黄芩苷的高效液相色谱（HPLC）含量检测，未见对其他成分的HPLC检测；贾纪萍等（2017）用薄层色谱定性鉴别了四黄止痢颗粒制剂中的盐酸小檗碱和黄芩苷，未进行定量分析。鉴于此，本实验以甲醇为提取溶剂，旨在建立HPLC同步测定四黄止痢复方中黄芩苷与小檗碱的方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 高效液相色谱仪 （L-7420），日本日立公司，配四联泵、脱气泵、紫外检测器和柱温箱；色谱柱，岛津InertSustian C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 天津市尚亚科技发展有限公司；旋转蒸发仪（RE-5203），上海亚荣生化仪器厂；超声波清洗器（KQ-300B），昆山市超声仪器有限公司。甲醇（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司；甲醇（色谱纯），天津市津东天正精细化学试剂厂；磷酸（分析纯），天津南开大学精细化工股份有限公司。黄连、黄芩、黄柏、大黄、板蓝根、甘草购自辽西国药店。盐酸小檗碱、黄芩苷对照品购自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 色谱条件 流动相：甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脱，有机相洗脱梯度为：0～5 min，20%～30%甲醇；5～10 min，30% ～40%甲醇；10～20 min，40% ～55%甲醇；20～30 min，55% ～60%甲醇；30～40 min，60% ～70%甲醇；40～ 50 min，70%～20%甲醇，流速1.0 mL/min；柱温25℃；检测波长为 278 nm；进样量 10 μL。

1.3 样品处理 将黄连、黄柏、黄芩、板蓝根、大黄、甘草6味中草药按照《中国兽药典》收载处方配比粉碎，称取复方中草药粉末5.0 g。按1∶80料液比加入60%甲醇，超声处理30 min后，离心取上清，旋转蒸发浓缩至干。用1 mL甲醇溶解，即为待测样品。

1.4 实验方法

1.4.1 标准曲线绘制 将黄芩苷、盐酸小檗碱用甲醇稀释成0.01～0.12 mg/L的系列工作标准液，进行液相色谱分析。每个浓度点重复测定3次，取平均值绘制色谱峰面积-浓度标准曲线。

1.4.2 加样回收率 称取6份已测定的黄芩苷和盐酸小檗碱含量的复方中草药提取物样品0.1 g，按1.3方法制备供试溶液，加入适量混合标准液，在1.2色谱条件下检测，重复6次，分析样品回收率。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择 在国标基础上以甲醇与0.1%磷酸水溶液为流动相，调整不同时间段流动相梯度，以黄芩苷、小檗碱能够完全分离为主要指标，且其他峰分离能够满足要求，获得了适宜的流动相洗脱梯度。

2.2 检测波长的选择 黄传俊等（2018）用HPLC法测定金蝉止痒胶囊中盐酸小檗碱和黄芩苷的研究中，检测波长分别使用了265 nm和280 nm，在本实验中，检测波长为278 nm可同时检测到黄芩苷和盐酸小檗碱。

2.3 色谱分离 由图1可知，在优化的色谱分离条件下，黄芩苷和盐酸小檗碱获得了良好的分离，盐酸小檗碱和黄芩苷两种化合物的保留时间分别为 23.998 min和 28.998 min。

2.4 标准曲线 将对照品系列浓度分别进样检测，以色谱峰面积（S）和对照品浓度（C，mg/L）作线性回归。在浓度为0.01～0.12 mg/L时，黄芩苷的标准曲线为 S=2×107C+972477，R2=0.9964；盐酸小檗碱的标准曲线为S=1×108C+231802，R2=0.9973。

2.5 加样回收率 由表1可知，盐酸小檗碱的平均回收率为98.058%，RSD值为0.914%；黄芩苷的平均回收率为98.400%，RSD值为0.896%。

2.6 精密度与重现性实验 在12 h内不同时间段测定样品中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量，每个时间段重复进样5次，6个时间段中盐酸小檗碱的平均含量为（4.68±0.06）mg/g，RSD 为 1.39%；黄芩苷的平均含量为（9.29±0.35）mg/g，RSD 为 3.74%。 结果表明本方法具有很好的精密度和重现性。

图1 样品和对照品HPLC色谱图

表1 加样回收率

3 结论

在甲醇-0.1%磷酸水为流动相进行梯度洗脱，检测波长为278 nm条件下，可以同步检测到四黄止痢复方中草药提取物中黄芩苷、盐酸小檗碱，并且该方法基线稳定，重复性理想，相对标准偏差＜1%，线性关系良好，两种组分分离理想，回收率高，均在98%以上，能够满足检测需求。所以本方法适宜同步测定四黄止痢复方中草药提取物中的黄芩苷、盐酸小檗碱含量。