长期施用含氯化肥对棕壤硝化作用及氨氧化微生物的影响

2019-06-17马凌云蔡芳芳张诗雨罗培宇杨劲峰韩晓日

植物营养与肥料学报 2019年5期

马凌云，王月，蔡芳芳，张诗雨，罗培宇，杨劲峰，韩晓日

（沈阳农业大学土地与环境学院/土壤肥料资源高效利用国家工程实验室/农业部东北玉米营养与施肥科学观测实验站，辽宁沈阳 110866）

硝化作用是土壤氮素转化的主要途径之一，由氨氧化 (NH3氧化成NO2-) 和亚硝酸氧化 (NO2-氧化成NO3-) 两个步骤组成，其中氨氧化过程是关键的限速步骤[1]，会影响土壤氮的利用效率与损失，对土壤氮循环起着重要作用。长久以来一直认为只有氨氧化细菌 (ammonia oxidation bacteria，AOB) 是氨氧化过程的主导者，直至氨氧化古菌 (ammonia oxidation archaea，AOA) 被发现[1]，并被证实在一些土壤中AOA的数量和分布均较AOB更丰富，在硝化作用中起主导作用[2-3]。国内外众多学者在多种土壤上就施肥对氨氧化微生物的影响进行了深入、系统的研究。大量研究表明，不同的土壤和施肥条件对土壤氨氧化过程影响不同，目前较为一致的观点是土壤pH、氨浓度、有机质等是影响土壤氨氧化微生物的主要因子。

然而近年来，随着氯化铵和氯化钾等含氯化肥的广泛施用，使大量的伴随离子—氯离子 (Cl-) 进入农田生态系统，参与了土壤和植物营养体系的物质循环。尽管Cl-极易随水流失，在土壤中的总残留率极低，但长期积累还是使施氯处理土壤Cl-含量显著增加[4-5]。一些研究认为，长期施用含氯化肥改变了土壤的理化性质、微生物活性和多样性[4，6-8]。有研究表明，含氯化肥对硝化作用有抑制作用[9]，但长期施用含氯化肥对硝化作用影响的报道较少。卢红霞[10]通过土培试验研究了不同浓度Cl-对滨海盐土、潮土、红壤中氮转化、土壤微生物数量的影响，结果表明凡施氯的处理亚硝酸细菌数量均明显减少。辜运富等[11]研究认为，施用KCl降低了土壤中硝化细菌的种群丰富度，可能是由于Cl-对硝化细菌形成毒害作用所致。秦子娴等[7]研究也表明，在中性紫色水稻土上经过21年施用含氯化肥，氨氧化潜势显著低于CK，认为可能是由于该处理pH显著降低而不适合AOB的生长，抑或是Cl-本身对AOB产生抑制作用所致。以上研究只是关注了AOB，而未对在硝化过程中起重要作用的AOA进行研究。Zhou等[8]在紫色土上研究结果显示，与其他处理相比，长期施用含氯化肥+有机肥的处理具有更显著的AOA群落结构和丰富的多样性，但该处理氨氧化潜势最低，认为在紫色土中pH在控制AOA群落结构和氨氧化活性中起重要作用。可见含氯化肥对硝化作用的抑制机理并不明确，在特定条件下，研究在硝化作用中起关键作用的AOB和AOA对长期施用含氯化肥的响应，可从微生物角度揭示含氯化肥抑制硝化作用的机理。

棕壤是辽宁省的主要耕作土壤之一，面积约7000多万亩，占全省耕作总面积的36.32%，是粮食的主产区。目前，关于长期施用含氯化肥对棕壤中氨氧化微生物影响的报道较少。本研究以沈阳农业大学棕壤含氯化肥长期定位试验 (始于1984年) 为基础，研究长期施用高氯和低氯化肥对棕壤AOA、AOB丰度以及氨氧化活性的影响，通过分析土壤基本性质、氨氧化活性和AOA、AOB丰度的相关性，探究影响棕壤AOA、AOB丰度的环境因子，以进一步认识施用含氯化肥对土壤硝化过程的影响及其机制，为含氯化肥的合理施用及氮素调控提供指导依据，确保农业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本研究土壤样品采自沈阳农业大学棕壤含氯化肥长期定位试验地 (40°48′N、123°33′E)，为黄土性母质上发育的棕壤。该地属于温带湿润-半湿润季风气候，年平均气温7～8.1℃，年降雨量为574～684 mm。该试验始于1984年，开始供试作物为玉米-玉米-大豆轮作，自2009年开始改为玉米-花生轮作，一年一季。共设置8个处理：T1 (不施肥)；T2(单施尿素)；T3 (尿素 + 氯化钾)；T4 (尿素 + 过磷酸钙)；T5 (尿素 + 过磷酸钙 + 氯化钾)；T6 (尿素 + 磷酸一铵 + 氯化钾)；T7 (尿素 + 氯磷铵 + 氯化钾)；T8(硝酸磷肥 + 过磷酸钙 + 氯化钾)。除CK外，各处理施用等量氮、磷、钾，其中T1、T2、T4为不施氯处理，T3、T5、T6、T8为低氯处理，T7为高氯处理。氮、磷、钾肥混合均匀，均做基肥一次施入。微区面积为2 m2，每个处理重复3次，完全随机区组排列。2009年后各处理具体施肥量如表1。

1.2 土壤样品的采集与处理

2017年种植花生，品种为 ‘花育20'；2018种植玉米，品种为 ‘东单6531'。于2018年4月种植前采集0—20 cm土壤样品。每个小区“S”形取5点土样均匀混合后，装入无菌塑料袋内用冰盒保持低温带回实验室，同时用铝盒采集土样进行含水量测定。将土样去除植物残体等杂质后过2 mm筛，分成三部分：一部分置于-80℃冰箱，用于DNA提取及后续氨氧化微生物丰度测定；一部分于4℃冰箱保存，并尽快测定铵态氮 (NH4+-N)、硝态氮 (NO3

表 1 2009年后种植玉米/花生年份各处理肥料施用量Table 1 Application rates of fertilizers in maize/peanut of each treatment after 2009 (kg/hm2)

--N)含量及土壤硝化潜势；其余样品风干，用于测定土壤氯离子 (Cl-) 含量及其他基本化学性质。

1.3 试验方法

土壤pH的测定以水土比2.5∶1浸提，用pH计(上海雷磁，PHS-3C)进行测定。

土壤中氯离子含量采用莫尔法测定。土壤中NH4+-N、NO3--N用0.01 mol/L氯化钙 (液土比 = 10∶1)浸提后，用AA3多通道流动分析仪(德国SEAL，AutoAnalyzer3)测定。其他基本化学性质按照常规方法[12]进行测定。土壤硝化潜势的测定采用氯酸盐抑制法[13]：以水土比4∶1向5 g土壤中加入含1 mmol /L(NH4)2SO4的磷酸盐缓冲液(NaCl 8.0 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO40.2 g/L，NaH2PO40.2 g/L；pH 值7.4)，并加入10 mmol/L KClO3溶液抑制亚硝酸盐的氧化。土样于25℃黑暗培养24 h后加入5 mL 2 mol/L KCl 溶液浸提NO2--N。NO2

-以 N-(1-萘基)-乙二胺显色，在540 nm波长下测定。硝化潜势用单位时间内单位土壤产生的NO2--N表示。

土壤总DNA提取：采用Dneasy PowerSoil土壤微生物DNA提取试剂盒 (QIAGEN GmbH，Germany)提取，所得DNA样品于-20℃冰箱中保存待用。

氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度分析[14]：以氨氧化细菌 (AOB)amoA基因和氨氧化古菌 (AOA) archamoA基因的拷贝数分别表示AOB和AOA的丰度。利用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)技术检测amoA和arch-amoA基因拷贝数，每个样品重复3次。AOB的引物为amoA-1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′) 和 amoA-2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)，反应程序为预变性95℃ 30 s，94℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；AOA的引物为arch-amoAF (5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′) 和 arch-amoAR (5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′)，反应程序为预变性95℃ 30 s，94℃变性10 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40个循环。采用 TB GreenTMPremix Ex TaqTM(2 ×) (Takara，大连)试剂盒，Real-time PCR反应体系为20 μL，其中DNA 模板 1 μL，19 μL 反应液，反应液包括 10 μL 2 ×TB Green、上下游引物各1 μL，灭菌超纯水7 μL。标准曲线以黑龙江黑土提取的DNA为模板进行AOA arch-amoA基因和amoA基因克隆制备质粒。将质粒连续稀释6个数量级作为标曲，其中AOA扩增效率为0.9，AOB扩增效率为1.04。

1.4 数据处理

数据采用PASW statistics18、Excel、Canoco等软件进行统计分析处理。含量明显高于不施肥处理，其中T8的NH4+-N含量最低，与T1处理相比下降了15.2%。高氯处理T7的NH4+-N含量最高为3.40 mg/kg，是T1处理的

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对土壤基本化学性质的影响

不同施肥处理对土壤基本化学性质的影响较大(表2)。其中，初始土为1984年耕层土壤。经过34年连续施用含氯化肥，土壤Cl-含量为高氯处理＞低氯处理＞不施氯处理，施氯的土壤Cl-含量显著高于不施氯的处理，其中高氯处理土壤Cl-含量为43.62 mg/kg，显著高于其他处理，是T1处理的3.5倍。与T1相比，所有施肥处理的土壤pH均显著降低，且高氯处理土壤pH最低为5.27，显著低于其他处理；其次是T2、T3处理，配施过磷酸钙的T4、T5、T8三个处理之间pH差异不显著，但显著高于T2、T3处理。施肥处理的土壤全氮、有机质均高于T1处理，施用含氯化肥对这2种养分含量影响较小。高氯处理土壤中碱解氮、速效磷、速效钾含量均最高，分别为91.01、24.88、131.05 mg/kg，其中速效磷含量显著高于其他处理。

2.2 不同施肥处理对土壤硝化作用的影响

2.2.1 不同施肥处理对土壤铵态氮、硝态氮的影响图1表明，除T5、T8处理外，其他施肥处理NH4+-N 2倍，且与其他处理差异显著。不同施肥处理对土壤NO3

--N含量影响较大，NO3

--N含量为10.02～15.38 mg/kg。其中T4处理NO3

--N含量最高，与T1处理相比提高了10.17%。T3处理NO3

--N含量显著高于其他低氯处理，与T1、T4处理间差异不显著，而低氯处理T5、T6和高氯处理T7间NO3

--N含量没有显著差异。2.2.2 不同施肥处理对土壤硝化潜势的影响土壤硝化潜势可以用来表征土壤的氨氧化能力。由图2可见，不同处理的土壤硝化潜势范围为1.48～4.48 mg/(kg·d)，处理间差异显著。其中高氯处理T7的土壤硝化潜势最低，显著低于其他处理，与T4相比降低了74.6%。与T1相比，T2、T3处理硝化潜势降低，但差异不显著；除高氯处理外，配施磷肥的T4、T5、T6、T8几个处理的硝化潜势显著高于未施磷肥的T1、T2、T3处理，且T4处理的土壤硝化潜势最高为4.48 mg/(kg·d)，与T1处理相比提高了60%。

2.3 不同施肥处理对土壤AOA、AOB丰度的影响

通过实时荧光定量PCR技术对AOA与AOB的amoA基因拷贝数进行了测定分析。从图3可以看出，各处理土壤中AOA丰度均显著高于AOB的丰度，且不同施肥处理土壤中氨氧化微生物丰度差异显著。AOA 丰度为 1.53 × 107～5.53 × 107copies/g 干土，AOB 丰度为 7.91 × 105～1.99 × 106copies/g 干土。

表 2 不同处理的土壤基本化学性质Table 2 Basic chemical properties of the tested soil in different treatments

图 1 不同施肥处理土壤铵态氮、硝态氮含量Fig. 1 Contents of soil ammonium and nitrate nitrogen in different treatments

图 2 不同施肥处理土壤硝化潜势Fig. 2 Soil nitrification potential in different treatments

图 3 不同施肥处理对土壤AOA、AOB丰度的影响Fig. 3 Abundance of archaeal and bacteria amoA gene in soils in different treatments

高氯处理T7的AOA丰度最低且显著低于其他处理，与T1相比降低了71.9%。T2、T3处理AOA丰度也较T1处理显著降低，分别降低了39.9%和30.2%，T4处理与T1处理差异不显著。除高氯处理外，同时施用氮磷钾肥的T5、T6、T8三个处理AOA丰度均低于T1处理，但显著高于T2、T3处理。与T1相比，除高氯处理外，各施肥处理均显著增加了土壤中AOB的丰度。高氯处理的AOB丰度最低，与T1差异不显著。与AOA类似，T4处理的土壤中AOB丰度最高为1.99 × 106copies/g干土，与T5差异不明显，但显著高于其他处理，比T1处理提高了151%。

2.4 AOA、AOB丰度与土壤化学性质、硝化潜势的相关性

由表3可知，不同施肥处理土壤AOA丰度、AOB丰度与土壤硝化潜势均呈显著正相关关系，且与AOA呈极显著正相关关系。AOA丰度与土壤pH呈极显著正相关，相关系数为0.835，而AOB丰度与土壤pH无显著相关性。土壤AOA丰度、AOB丰度与其他土壤化学性质均无显著相关性。

由冗余分析(图4)也可看出，施用含氯化肥34年后，AOA和AOB丰度均对土壤硝化潜势产生明显影响，土壤pH仅对AOA丰度有明显影响，而速效磷、速效钾、碱解氮等其他化学性质对土壤氨氧化微生物丰度无显著影响。

表 3 AOA、AOB丰度与土壤化学性质、硝化潜势的相关性Table 3 Correlation coefficient among AOA and AOB abundance and soil chemical properties

图 4 土壤氨氧化微生物与基本化学性质的冗余分析Fig. 4 Relationship among soil cochemical properties and ammonia-oxidizing microorganisms in soil described with redundancy analysis

3 讨论

3.1 长期施用含氯化肥对土壤化学性质和硝化作用的影响

连续施用含氯化肥34年后，土壤基本性质发生了显著变化。尽管高氯处理土壤中Cl-含量显著增加，但不会对作物产生危害，因其浓度远低于作物耐氯临界值[15]。长期施用含氯化肥降低了土壤pH，邹长明等[16]、侯小娟等[17]研究也表明，长期施用含氯化肥土壤pH有下降趋势，会造成土壤酸化，与本试验结果一致。其中高氯处理降低得更多，显著低于其他处理，与T1相比降低了22.16%。这与吴金桂等[18]的研究结果类似。造成土壤酸化的原因，一方面是由于含氯肥料为生理酸性肥料，长期施用会导致土壤pH下降；另一方面可能是由于氯能抑制铵态氮的硝化作用[9]，而使作物在吸收铵态氮的同时，释放出大量氢离子，提高了土壤的酸度。除高氯处理外，配施磷肥的几个处理缓解了土壤酸化。速效氮、磷、钾均在高氯处理的土壤中含量最高，李海云等[19]研究也表明，含氯化肥有利于土壤中速效氮、磷、钾积累。

本研究中，高氯处理的土壤NH4+-N含量显著高于其他处理，且硝化潜势最低。表明施高氯抑制了土壤硝化作用，使更多的氮素以铵的形式存在，这与周丕东等[20]的研究结果一致。这应该是由于高氯处理土壤pH显著降低，影响了土壤中硝化微生物的活性导致硝化作用减弱[21]，或是高浓度的Cl-对氨氧化微生物产生了毒害作用所致[11]。除高氯处理外，其他配施磷肥的处理硝化潜势均显著高于未施磷肥的处理，T4 ＞ T2，T5 ＞ T6 ＞ T8 ＞ T3，其中 T4 处理硝化潜势最高，说明施用磷肥促进了土壤的硝化潜势，这与以往的研究结果一致[8,14,22-23]。T1、T2、T3处理之间硝化潜势没有差异，而且这些处理中速效磷含量相对较低，进一步表明磷可能是土壤硝化潜势的限制因子，这与Zhou等[8]在紫色土上的研究结果类似。

3.2 长期施用含氯化肥对土壤AOA、AOB丰度的影响

在所有处理中，氨氧化古菌AOAamoA基因的丰度 (1.53 × 107～5.53 × 107copies/g) 均显著高于氨氧化细菌 AOB (7.91 × 105～1.99 × 106copies/g)，二者比值为18.0～68.8，土壤中AOA的数量明显多于AOB，这与罗培宇等[24]在棕壤上的研究结果一致。AOA的数量及AOA与AOB数量的比值均与土壤pH呈极显著正相关关系 (r= 0.835**、r= 0.894**，P＜ 0.01)，即随土壤pH的增加而增加，而AOB的数量与pH之间没有相关性。李秀玲[25]在棕壤上的研究也认为，AOA的丰度与土壤pH呈显著正相关关系，与本研究结果一致，而张苗苗等[14]在南方酸性红壤上的研究结果显示AOA的数量及AOA与AOB数量的比值随土壤pH的增加而降低，与本研究结果相反，这可能是由于土壤类型不同而造成的差异。本研究中施用高氯的处理AOA和AOB的丰度均显著低于其他施肥处理，可能是由于高氯处理进一步降低了土壤的pH，致使AOA和AOB的数量降低，或是该处理中累积的高浓度氯离子对氨氧化微生物产生了抑制作用，其具体机理还有待进一步验证。除高氯处理外，其他配施磷肥的处理AOA的数量均显著高于不施磷处理，AOB的数量也是除T6和T7处理外施磷处理显著高于不施磷处理，这说明磷也会影响土壤中氨氧化微生物，这与以往的研究结果类似[14]。