便携式光纤拉曼胃癌检测仪的研发和应用

韦仲，毛华，黄富荣，方涛

1.南方医科大学珠江医院 消化内科，广东 广州 510282；2.暨南大学 光电工程系，广东 广州 510632

引言

拉曼光谱是一种散射光谱，可以对物质的结构和成分进行定性和定量分析，其检测过程不需要对样品进行特殊预处理，也不会对样品造成损伤，具有操作简便、检测速度快、精确度高、客观性强等优点，在医学诊断中具有较大的应用优势[1-2]。拉曼光谱用于胃癌的诊断研究已经有十余年，研究对象包括离体胃癌细胞[3]、胃癌组织[4]、胃癌动物模型[5]、胃癌患者的血清[6]等，研究手段包括傅里叶变换拉曼光谱[7]、表面增强拉曼光谱[8]和光纤拉曼光谱[9]等。上述研究的结果均从不同角度证实了拉曼光谱能够鉴别胃癌，为拉曼光谱技术向临床应用推广奠定了基础。

既往的研究为了获取精确的光谱数据，所使用的拉曼光谱仪均为激光共聚焦显微拉曼光谱仪，具有检测精度高、定位准确、外界声噪小的特点，该类设备体积大、质量重，不能随意移动，价格昂贵，需要定时由专人进行日常维护，需要在暗室环境下进行检测，在临床诊断方面的实用性大打折扣。便携式拉曼光谱仪具有体积小、质量轻、便于携带、价格低廉等优势，随着技术的发展，便携式拉曼光谱仪的检测性能，如分辨率、灵敏度、稳定性、抗干扰能力等方面，有了极大的提高，使检测结果更加准确、可靠，已经广泛应用于制药在线监测[10]、爆炸物监测[11]、机场安检[12]、食品安全[13]、考古[14]、农业[15-16]、生物医学检验[17]等方面的现场检测。但是便携式拉曼光谱仪在临床诊断方面的应用研究并不多见，在胃癌的诊断应用更少，因此本文介绍了一种便携式光纤拉曼胃癌检测仪，初步探讨该设备对胃癌检测的可行性，为更进一步研制开发基于内窥镜的光纤拉曼光谱系统提供理论参考。

1 便携式光纤拉曼胃癌检测仪的研发

1.1 工作原理

由激光器发出一束激光，经输出光纤传导，由光学系统聚焦照射在待测样品上，产生拉曼效应。拉曼检测仪的探头对样品产生的拉曼散射光进行收集，经由输入光纤传输给拉曼光谱仪，转换为相应的电信号，传递至计算机进行信号处理，最终得到拉曼光谱图像。便携式光纤拉曼胃癌检测仪的原理示意图，见图1。

图1 便携式光纤拉曼胃癌检测仪的原理示意图

1.2 系统组成

1.2.1 激发光光源

激光具有定向发光、方向性好、亮度极高、颜色极纯、相干性高等优点，因此激光是作为激发光源的最优选择。常用的激光器有的 514.5 nm Ar离子激光器、632.8 nm 的He-Ne激光器、532 nm或者785 nm的半导体激光器。根据既往的研究[18]可知，在应用拉曼光谱技术检测肿瘤组织时，多选用近红外波段（780～2526 nm）的激光。在这个波段区间内，肿瘤组织的成分中电子从基态跃迁较少，产生的自体荧光现象较弱，因而荧光干扰也较低，而且相对能量较弱的光子不易使肿瘤组织吸收热量过多而产热分解。根据研究需求，本设计定制了785 nm半导体激光器作为激发光源。

1.2.2 光纤探头

便携式光纤拉曼胃癌检测仪的光纤探头的主要功能有两个，一是输出激光，使待测样品产生拉曼效应，激发拉曼光信号；二是输入光纤，接收样品所产生的拉曼信号，滤除包括入射激光在内的非拉曼信号，并将拉曼信号导出至光谱仪中。

目前拉曼光纤探头主要有双光纤探头和多光纤探头[19]。双光纤探头中的两根光纤，一根用于激发样品，一根用于收集拉曼信号，但是由于光纤本身的背景噪声较大，不利于提高便携式光纤拉曼胃癌检测仪的有效率和准确率，通过理论分析和蒙特卡罗模拟法（Monte Carlo Simulation，MCS），选用多光纤探头，建立了适用于便携式光纤拉曼胃癌检测仪的深度分辨拉曼光纤探头。

1.2.2.1 光纤种类的选择

查阅文献可知[20]，在785～1200 nm激发光波长范围内，低羟基浓度的光纤在传递拉曼信号过程中，信号衰减更小，同时也可以减少光纤的拉曼散射和荧光效应，因而选择低羟基浓度的光纤。

1.2.2.2 光纤的参数选择

光导纤维是一种透明的玻璃纤维丝，直径只有1～100 μm左右。它是由内芯和外套两层组成，内芯的折射率a大于外套的折射率b，光由一端进入，在内芯和外套的界面上经多次全反射，从另一端射出。光纤的主要参数为数值孔径（Numerical Aperture，NA）表征了光纤收集光信号的能力，定义为：

目前公认，当NA为0.18～0.23时，光纤探头的采集效率和组织探测深度达到最理想的水平[21-22]。通过对不同NA值的光纤进行传导效率测定（图2），便携式光纤拉曼胃癌检测仪选择NA值为0.22的光纤。

图2 NA值对传光效率的影响

1.2.2.3 光纤数量选择

以发射和收集相分离的设计，内部包含多根收集光纤环绕1根激发光纤，既能够减小发射光纤中产生的背景信号的干扰，又能增大探头直径，提高收集效率。通过MCS分析可得，采用六边形结构的光纤排列能够使得光纤探头的设计更加灵活，信号作用的有效范围最大化，结构如图3所示。光纤数目满足公式：

图3 光纤排列结构示意图

1.2.2.4 光纤末端角度选择

最早由Wilson等[23]在1999年提出，将光纤末端切成一定的角度，可以增加拉曼信号的收集效率。Wang等[24]探索研制在体内窥镜的报道中也指出，搭配斜面的光纤可以明显接收拉曼信号的效率，利用MCS发现当NA=0.22时，搭配斜面光纤的接收效率至少是平面光纤的1.8～4倍。光纤斜面角度（B）对收集效率的模拟，见图4。

图4 光纤斜面角度对收集效率的模拟

1.2.2.5 光纤封装方式

激发光纤和收集光纤需同时封装于探头的一端，需保证既能减少外界声噪的干扰，又可以尽量减少拉曼信号的丢失。对于激发光纤，一端采用FC接口封装，与激光器输出接口对应，另一端采用直径为4 mm的金属套筒封装，并将光纤出口置于套筒端面中心；对于收集光纤，一段采用“外螺纹＋孔”“内螺纹＋针”即Small A Type（SMA）接口封装，具有高力学强度、高耐久性、高可靠性及低回波损耗等显著特点，匹配相应接口的拉曼光谱仪，另一端采用同样的封装。激发光纤和手机光纤封装接口，见图5。

图5 激发光纤FC接口和收集光纤SMA接口

1.2.2.6 物镜的设计

为了保证入射激光能够准确地照射在待测样品上，通常会在激发光纤前加装光纤准直器，球面透镜是最常用的装置，在物镜加上一球面透镜可以起到聚焦光纤的作用，能够在一定程度上提高探头的采集效率。物镜的直径可根据球面透镜的直径来确定，所设计的物镜直径15 mm，入射光经过透镜后所形成的入射光斑点有效照射直径为1 mm。物镜侧面示意图，见图6。

图6 物镜侧面示意图

1.2.3 微型光谱仪

微型光谱仪是便携式光纤拉曼胃癌检测仪的核心部件，其性能直接影响到系统的检测范围和光谱分辨能力，通常来说，光谱仪的光谱范围越大，相应的光谱分辨力就会越低。目前便携式拉曼光谱仪所采用的光谱仪光学结构主要有四种，经典的车尼尔-特尔纳（C-T）结构，体全息透射光栅结构，全息凹面平场光栅结构，中阶梯光栅结构。本设计选用由荷兰（北京）爱万提斯科技有限公司生产的AvaSpec-ULS2048LTEC光谱仪，具有高稳定性、高灵敏度、高采样速度、低噪声、大动态范围的特点。

利用785 nm半导体激光器、传导光纤、光纤探头、微型光谱仪、载物台及安装光谱分析软件的计算机构建便携式光纤拉曼胃癌检测仪，系统全貌如图7所示，主要参数如表1所示。

图7 便携式光纤拉曼胃癌检测仪

表1 便携式光纤拉曼胃癌检测仪主要参数

2 胃组织标本检测

2.1 实验设备

实验中使用的设备是便携式光纤拉曼胃癌检测仪和激光共聚焦显微拉曼光谱仪。激光共聚焦显微拉曼光谱仪由英国RENISHAW公司生产，基本参数设置为激发光波长785 nm，分辨率 1～2 cm-1，最大激发光功率约 300 mw，最大波谱范围 100～3200 cm-1。

2.2 实验方法

收集行电子胃镜检查并经病理证实的正常胃粘膜组织和胃癌组织各10例，分别用便携式光纤拉曼胃癌检测仪和激光共聚焦显微拉曼光谱仪进行光谱采集。

2.2.1 便携式光纤拉曼胃癌检测仪

在普通实验室环境下，将待测样本置于载玻片表面，光纤探头以支架固定，探测端与待测标本紧密接触，以模拟临床原位检测。调整激光照射至待测样本，经3次扫描累加，完成1次扫描，每个样品重复测量3次取平均值，重复采集以保证实现光谱的可重现性。

2.2.2 激光共聚焦显微拉曼光谱仪

在暗室中，将载玻片置于载物台，用10倍目镜观察组织样品，调整物镜方位，使激光焦点聚集到组织样品上，按预设参数获得样品组织的拉曼光谱经3次扫描累加，每个样品重复测量3次取平均值，重复采集以保证实现光谱的可重现性。

2.3 实验结果

原始光谱信号包括自体荧光信号、噪音和拉曼信号，利用Raman-Wire3.2软件和一种基于R语言的背景去噪程序，只留下组织的拉曼光谱信号。使用Matlab及Origin Pro8软件在计算机上对所得光谱图进行处理比较。图8和图9显示为两种设备获取的正常胃粘膜组织和胃癌组织平均拉曼光谱，从图中可以看到，胃粘膜组织的主要拉曼光谱 波 峰 位 于 829、853、964、1003、1032、1154、1316、1450、1659 cm-1。其归属主要来源于蛋白质和脂类，与已知的结果是一致的。便携式光纤拉曼胃癌检测仪所获取的光谱结果虽然在强度上略有差异，但其所表现的光谱具有较好的完整性。

图8 正常组织的拉曼光谱

图9 胃癌组织的拉曼光谱

3 讨论及总结

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国有较高的发病率和死亡率，及早诊断对胃癌预后意义重大[25]。大量的基础研究已经证明，拉曼光谱技术可以实现无损、快速、客观地鉴别出胃癌组织和正常组织，将这一技术与临床结合，为胃癌的诊断提供了新的技术和思路。本文阐述了一种便携式光纤拉曼胃癌检测仪，785 nm半导体激光器能合理激发样本组织产生拉曼效应，独立设计研制的光纤探头能够实现良好的传导和收光，微型光谱仪能够实现实时光电转换，输出可视化光谱。利用该系统在普通环境中对正常胃粘膜组织和胃癌组织进行检测，获得的光谱与共聚焦显微拉曼光谱仪所测同类样品的光谱具有较高的一致性，说明该系统具有较好的检测能力，更重要的是便携系统本身具有体积小、质量轻、便于携带及维护、价格低廉等优势，为实现临床应用提供了可能。下一步，将在此基础上继续研究，继续将设备微型化，设计研发一种可以通过胃镜检测孔的检测设备，实现在常规胃镜检查的同时，对胃黏膜进行拉曼检测以鉴别正常组织和癌变组织，为临床诊断提供依据。