子宫托细胞毒性试验两种方法的比较

刁立琴 康莉 付钊 高保栓 韩婷 河北省医疗器械与药品包装材料检验研究院 （河北石家庄 050061）

内容提要：目的：比较两种细胞毒性试验方法对子宫托细胞毒性评价的差异。方法：GB/T14233.2-2005的MTT法和GB/T 16886.5-2017的MTT法。结果：RGR分别为13%和75%。结论：细胞毒性试验方法的选择应根据样品的理化性质，模拟临床的实际使用情况进行选择。

子宫托是一种Ⅱ类医疗器械，其材质主要为聚乙烯和硅橡胶类。经临床观察，使用子宫托治疗盆腔器官脱垂，可以明显缓解患者脱垂和排尿相关症状，改善患者的生活质量。因其损伤小，操作简单，安全有效，在盆腔器官脱垂治疗中被广泛应用，近些年又被拓展到压力性尿失禁、宫颈功能不全和盆底功能障碍等相关疾病的治疗中[1]。随着我国人口老龄化的加速，盆底功能障碍患者逐渐增加，子宫托的应用将更为广泛，正确评价其安全性尤为重要。

体外细胞毒性试验具有简便、快速、敏感性高的特点，是医疗器械生物学评价体系中常用的检测指标之一，是一种离体状态下模拟生物生长环境，检测医疗器械产品接触人体组织后生物学反应的体外试验。本文分别用GB/T14233.2-2005和GB/T 16886.5-2017中的MTT试验方法对子宫托的细胞毒性进行测定比较。

1.材料与方法

1.1 一般材料

试验样品：子宫托（来自生产企业送样，材质为硅橡胶类）。

细胞：小鼠成纤维细胞L-929（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心）。

主要试剂：1640培养基（北京索莱宝生物科技有限公司），MEM培养基（赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司），胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd，DMSO（SIGMA-ALDRICH），异丙醇（天津市百世化工有限公司），ZDBC的聚氨脂膜（Hatano Research Institute，FDSC）。

1.2 方法

1.2.1 GB/T14233.2-2005中MTT试验方法

试验液的制备。①样品浸提液：取样品，剪成约1cm×3cm小条，按0.2g/mL的比例，加入含10%血清的1640培养基，37˚C浸提24h备用；②空白对照液：同批含10%血清的1640培养基，同法制备；③阴性对照液：高密度聚乙烯按0.2g/mL的比例，加入含10%血清的1640培养基，同法制备；④阳性对照：5g/L的苯酚溶液，同法制备。

试验方法。按照GB/T14233.2-2005规定的MTT试验方法进行[2]。将1×104/mL细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，置5%CO2培养箱中37˚C培养24h后，弃去原培养液。分别加入样品浸提液、空白对照液、阴性对照液和阳性对照液，每孔100μL，置CO2培养箱中37˚C培养72h，然后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，继续培养4h后弃去孔内溶液，加入DMSO 150μL，振荡10min，在酶标仪570nm和630nm双波长下测定吸光度（OD值）。按公式（1）计算细胞相对增殖率（RGR）：

表1. MTT法细胞毒性反应分级(%)

注：RGR——相对增殖率，%；A——供试品组（阴性组、阳性组）吸光度；A0——空白对照组吸光度。（MTT浓度为5g/L，溶于PBS溶液。）

结果判定。根据RGR按表1分级标准判定。阴性对照组的反应不大于1级，阳性对照组的反应至少为3级时，判定结果可靠。

1.2.2 GB/T 16886.5-2017中MTT试验方法

试验液的制备。①样品浸提液：取样品，剪成约1cm×3cm小条，按0.2g/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培养液，37˚C浸提24h备用；②空白对照液：同批10%胎牛血清的MEM培养液，同法制备；③阴性对照液：取高密度聚乙烯膜按表面积3cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培养液，同法制备；④阳性对照液：取含ZDBC的聚氨脂膜按表面积3cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培养液，同法制备。

试验方法。按照GB/T 16886.5-2017规定的MTT试验方法进行[3]。将1×105/mL细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL。置5%CO2培养箱中37˚C培养24h后，弃去原培养液。加入样品浸提液、空白对照液、阴性对照液和阳性对照液，每孔100μL置CO2培养箱中37˚C培养24h。除去原培养液，每孔加入1g/L的MTT溶液50μL，继续培养2h后除去孔内MTT溶液，加入100μL异丙醇，振荡10min，在酶标仪570nm和650nm双波长下测定吸光度（OD值）。按公式（2）计算存活率：

注：OD570e——试验样品组（阴性、阳性对照组）光密度平均值；OD570b——空白对照组光密度平均值。（MTT浓度为1g/L，新鲜溶于不含酚红的MEM溶液。）

结果判定。当细胞存活率下降到＜空白的70%，则具有潜在的细胞毒性。

2.结果

GB/T14233.2-2005MTT法的RGR为13%（见表2），GB/T16886.5-2017MTT法的RGR为75%（见表3），两者差异明显。

3.讨论

同种样品的细胞毒性试验用GB/T 16886.5-2017MTT方法得出的RGR结果明显高于GB/T14233.2-2005MTT方法的RGR结果。分析原因如下。

GB/T14233.2-2005的细胞接种密度为1×104/mL，而GB/T 16886.5-2017的细胞接种密度为1×105/mL，两者相差10倍。同时镜下观察，细胞形态均正常，生长良好。前者细胞密度稍显稀疏，后者稍显致密，考虑接种密度为1×104/mL时，L929细胞在24h仍处于缓慢增殖状态，会扩大细胞对待检物的反应；而接种密度为1×105/mL时，细胞在24h后便进入了对数生长期，细胞状态较为稳定。同时也有相关文献试验证明，细胞种板数目增大，细胞增殖率逐渐增高，这和本试验得出的测试结果一致[4]。

GB/T14233.2-2005在浸提液中培养时间为72h，而GB/T 16886.5-2017在浸提液中培养时间为24h。随着培养时间的延长，由于浸提液中硅橡胶聚合物的降解片段会进一步降解，在较小体积中逐渐累积，对细胞毒性的影响较为持续而显著。

表2. GB/T14233.2-2005MTT法试验结果

表3. GB/T16886.5-2017MTT法试验结果

不同的浸提介质在浸提样品时，在溶液条件下发生相互作用，因浸提液的成分不同可能也会导致结果差异。

GB/T14233.2-2005方法中在加入MTT前没有去除浸提液，而GB/T 16886.5-2017方法中则全部去除浸提液后再加入MTT，考虑在浸提液环境下，样品浸提析出的成分有可能和MTT反应，而影响结果出现差异。

总之，目前GB/T 16886.5-2017中的MTT法和GB/T14233.2-2005的MTT法作为国家标准，被多数企业直接引用到评价申报医疗器械生物安全性，但是并不代表该试验方法适合所有医疗器械。同时，体外细胞毒性试验条件和临床实际使用的环境条件存在差别，尤其某些降解、溶出的材料应谨慎对待[5]。当前医疗器械产品种类繁多，发展迅速，如何客观的评价医疗器械的细胞毒性，方法的选择尤为重要，需要全面了解产品的理化性质，尽量模拟样品实际使用情况或严于样品实际使用条件进行试验。建议根据产品材料的不同，选择适宜的细胞毒性试验方法。