土壤微生态环境对冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫病原菌粉棒束孢宿存及毒力的影响研究

贺元川， 鲁增辉， 游华建， 陈仕江

(1. 重庆市中药研究院，重庆 400065; 2.甘孜州康定贡嘎中华虫草产业有限责任公司，四川 康定 626000)

粉棒束孢(Isariafarinose)隶属于拟青霉属，可寄生于鳞翅目、膜翅目，鞘翅目等昆虫，广泛分布于世界各地，是自然界中控制昆虫种群的重要因子[1]。粉棒束孢可作为性能良好的杀虫微生物资源，广泛应用于农业和林业的害虫防治[2]，防止昆虫对植被或者生态环境的破坏，但是在名贵中药材冬虫夏草资源的研究中发现，粉棒束孢是蝙蝠蛾幼虫的主要病原菌之一[3]，严重影响冬虫夏草的产量，被列为冬虫夏草培植的重要病害，也是限制冬虫夏草产业化的瓶颈。野外调查发现自然环境中粉棒束孢病害发生率较低，而在室内人工饲养环境中粉棒束孢的病害发生率高，严重影响了蝙蝠蛾幼虫的存活率，进而影响冬虫夏草的产量[3-4]。土壤既是土栖昆虫的主要生长环境，也是虫生真菌的主要栖息地，是保护虫生真菌的良好环境和重要的接种库。虫生真菌未接触到寄主昆虫前，病原真菌以孢子形式存在于土壤中营腐生生活，有利于种群的建立延续和稳定，对虫生真菌流行病的发生具有十分重要的意义[5]。粉棒束孢病害调查结果推测室内饲养土壤环境更适合粉棒束孢的腐生，可侵染昆虫的不同生长发育阶段，导致病害规模化的发生，野外自然环境等综合因素导致粉棒束孢极少发生规模化爆发[4]。中外学者对白僵菌和绿僵菌等虫生真菌的研究结果显示，土壤的温度、含水量、有机物组成以及微生物种类等对虫生真菌宿存和毒力具有显著影响，并认为低温、低含水量、避光等条件有利于白僵菌孢子的宿存、菌落形成和毒力的保存，土壤中微生物的存在可能会阻碍孢子的萌发及生长[6-16]。与中高温型虫生真菌白僵菌和绿僵菌的研究相比，低温型虫生真菌粉棒束孢在土壤中关于宿存及毒力变化的研究尚未见报道[17-20]。虫生真菌所处环境、寄主的相互作用将影响其种群动态和毒力的变化。虫生真菌退化后常常采用寄主昆虫感染来复壮虫生真菌的毒力[21-22]。在冬虫夏草培育过程中，粉棒束孢是冬虫夏草寄主昆虫微生物病害的主要病原菌，其种群动态和毒力将直接影响寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫的存活率和冬虫夏草的产出率。目前针对粉拟青霉的病害研究主要集中在防治、发病机理等方面，缺少粉棒束孢宿存规律、影响因子和毒力变化的研究报道[23-25]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 供试菌株粉棒束孢分离自康定虫草基地的粉棒束孢病害死虫，采用单孢分离法获得的粉棒束孢菌株，在固体斜面上培养10 d，用0.05% 吐温-80的无菌水溶液制备108个/ mL孢子悬液。

1.1.2 供试昆虫 健康的3龄蝙蝠蛾幼虫，取自海拔3 800 m的康定雅家梗虫草基地。

1.1.3 土壤来源 野外冬虫夏草试验地的土壤(高山草甸土)和室内蝙蝠蛾幼虫饲养土壤。

1.1.4 改良PDA培养基 链霉素 100 U/mL; 马铃薯200 g/L(去皮，切块煮沸30 min，纱布过滤)，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，蒸馏水1 000 mL。灭菌后倾倒平板并置于无菌室放置1 d，备用。

1.2 方法

1.2.1 温度对粉棒束孢宿存的影响 将所取土壤消毒干燥后分为4组，含水量55%，添加粉棒束孢含量至108个/g，重复3次，分别置于30、20、12、-18 ℃保存。同时培养并测定不同温度条件下孢子萌发率，观察菌丝生长状况。

1.2.2 含水量对粉棒束孢宿存的影响 将所取土壤消毒干燥后分为5组，分别调节含水量(每100 g干土所含水的百分比)至25%、35%、45%、55%、65%。添加至粉棒束孢含量至108个/g，重复3次，12 ℃基地自然温度保存。

1.2.3 土壤微生物对粉棒束孢宿存的影响 将所取的野外高山草甸土和室内饲养土壤分别分为2组，第1组直接加入粉棒束孢，初始含量为108个/g，第2组经过121 ℃消毒30 min后加入粉棒束孢初始含量为108个/g，土壤含水量调至55%，保存温度12 ℃，重复3次。

1.2.4 取样 用圆柱形取样器(直径4.5 mm)在试验盒处理区内随机5点式取样。前60d，每10 d取样1次, 60 d后每月取样1次，每次取样厚度15 cm，每次取样后准确称取1 g土壤，烘干并称量干土重量，用于计算土壤中粉棒束孢含量。

1.2.5 粉棒束孢的菌落形成单位(CFU)的测定 准确称量土壤样品1 g，置于250 mL三角瓶中，加入100 mL含有0.05 mL吐温-80的无菌水溶液，振荡器上充分混匀，依次稀释至10-7倍，用移液管取100 μL添加至含链霉素的PDA的培养基上涂布均匀，各浓度设定3个重复，20 ℃培养5 d后记录菌落数，选取菌落数在10～100之间的数值作为测定依据，计算取样点平均菌落形成单位。

1.2.6 毒力测定 分别从每组试验宿存12个月土壤中分离粉棒束孢，选取产孢量高、萌发率高的菌株各3株，用于毒力测定。首先将分离的菌株20 ℃固体培养10 d后，用含有0.05%吐温-80的无菌水洗脱制备108个/g孢子液，然后将3龄蝙蝠蛾幼虫浸入孢子悬液10 s后取出，自然晾干水分，放入单头盒内裸露避光饲养，饲喂消毒的胡萝卜，温度(12±1) ℃，相对含水量(55±5)%，每3 d更换一次饲料，每天观察和记录死亡情况，统计1周的死亡率。每个菌株接种10头。同时以灭菌的孢子液和初始菌株分别做阴性对照和阳性对照。

2 结果与分析

2.1 温度对粉棒束孢宿存及毒力的影响

温度是影响真菌孢子萌发、宿存的重要因素之一。图1显示：粉棒束孢在20 ℃时萌发快，萌发率高；12 ℃时孢子萌发延迟，但整体萌发率尚未受到影响；30 ℃时孢子萌发抑制，孢子萌发率显著下降，可能是温度过高，导致孢子失活。粉棒束孢在20 ℃时生长7～10 d后，菌落直径约20～25 mm，12 ℃时生长缓慢，需要15～18 d，30 ℃时菌丝生长被抑制，培养7～10 d后菌落菌丝稀疏，菌落较20 ℃时偏小。图2、3显示，相同温度下，同等时间内，高山草甸土壤中粉棒束孢含量下降更快，低于室内土壤，这可能与二者存在的营养物质、微生物代谢产物等有关。30 ℃时粉棒束孢宿存量下降最快，可能因为温度过高导致孢子失活和抑制菌丝生长，而-18 ℃时宿存量下降缓慢，1年后仍然保持在106个/g[26]。12～20 ℃时粉棒束孢整体先缓慢上升后再直线下降，保存60 d后，除低温外粉棒束孢宿存量均直线下降，随着温度的升高，粉棒束孢宿存量下降更快，可能是粉棒束孢利用土壤中的营养物质繁殖，导致宿存量的缓慢上升，随着营养物质的减少，宿存量开始下降。从上述结果可以看出，不同温度对粉棒束孢的土壤宿存量的影响有显著差异，高温不利于粉棒束孢宿存，低温环境可维持较高的菌群数量，有利于粉棒束孢的宿存，温度适中，则可能出现波动，有利于粉棒束孢的传播及病害的发生。

图1 温度对粉棒束孢孢子萌发率的影响

图2 温度对高山草甸土中粉棒束孢宿存的影响

2.2 含水量对粉棒束孢宿存及毒力的影响

蝙蝠蛾幼虫最适生长温度为10 ℃～12 ℃，为了更好地研究该环境下粉棒束孢宿存的情况，测定了12 ℃条件下不同含水量对粉棒束孢宿存情况的影响。图4、5显示不同含水量条件下随着保存时间的延长，粉棒束孢宿存量均降低。在低含水量环境条件下(25%～35%)，粉棒束孢宿存量缓慢减少，1年后宿存量仍维持在104个/g。在中高含水量环境条件下(45%～65%)随着含水量的增加，粉棒束孢宿存量先增加后下降，同等时间内高山草甸土壤低于室内土壤的宿存量但均降低。由于土壤来源不同，土壤中营养物质也有差异，对粉棒束孢的生长表现出不同的作用，在低含水量环境下，可能导致孢子失水等，不利于孢子的萌发和宿存，而高湿环境，孢子可快速萌发，消耗营养，但是因为营养有限，后期环境不利于孢子的宿存，随着时间延长出现宿存量降低。

图3 温度对室内土壤中粉棒束孢宿存的影响

图4 湿度对高山草甸土壤中粉棒束孢宿存的影响

2.3 微生物对粉棒束孢宿存的影响

粉棒束孢虽然分布广泛，但是土壤中存在的某些微生物对其生长有一定的抑制作用，能有效防止其病害大爆发。图6显示土壤微生物显著影响粉棒束孢宿存。未消毒土壤中含有丰富的微生物，部分可能竞争性抑制粉棒束孢的生长或者产生拮抗作用，导致早期宿存量的降低，随后由于环境适应等又缓慢增长，随着营养的减少再逐渐降低。消毒后的土壤微生物被杀灭，但存在的少量的微生物代谢产物抑制了粉棒束孢生长，导致粉棒束孢宿存量暂时减少，由于消毒后的土壤中微生物可作为营养物质，粉棒束孢宿存量降低后开始持续增长至3个月，增长量显著高于未消毒土壤，3个月后再出现宿存量的缓慢降低。室内饲养土壤比高山草甸土壤更利于粉棒束孢的宿存，这可能与来源不同的土壤微生物种类及代谢产物、营养物质有关。

图5 湿度对室内饲养土壤中粉棒束孢宿存的影响

图6 土壤微生物对粉棒束孢宿存的影响

2.4 环境因子对粉棒束孢宿存后毒力的影响

微生物保存过程中，其活力与温度、含水量、营养等密切相关，土壤样品的长期保存对其微生物的种类和多样性均有影响[27]。表1结果显示，温度、含水量与微生物种类对土壤中粉棒束孢宿存过程中毒力的影响显著。粉棒束孢在同一来源土壤中保存1年后，温度越高，毒力下降越多，低温有利于毒力保存；含水量对毒力的影响无明显规律，这可能与孢子对干燥和高湿环境采取不同策略所致，可能低含水量环境孢子萌发少，保存其毒力；高含水量环境孢子萌发快，重新产孢维持毒力。微生物对粉棒束孢的毒力影响具有显著差异，在野外的高山草甸土壤中，微生物的存在不利于粉棒束孢毒力的保存，而室内饲养土壤环境则有利于粉棒束孢的毒力保存，这可能与土壤中微生物的种类和数量、代谢产物等有关。

表1 环境因子对粉棒束孢毒力的影响

3 讨 论

粉棒束孢是一种分布广泛的虫生真菌，是冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫的主要病原菌之一，严重影响人工饲养蝙蝠蛾幼虫的存活率，成为限制冬虫夏草产业化的瓶颈[4]。通过对粉棒束孢的防控，从源头控制粉棒束孢的数量，可有效降低病害发生率。粉棒束孢在冬虫夏草的培殖中被列为主要病害，与作为生防菌的研究方向和目的截然不同。现有文献主要是研究如何控制已经发生的粉棒束孢病害，但对其在土壤中的宿存情况、变化规律，尚未有文献报道。为了更好地控制该病害的发生，了解其宿存和毒力的影响因素尤为重要。本研究分析了温度、含水量、微生物对粉棒束孢宿存和毒力的影响，特别关注了蝙蝠蛾饲养环境下粉棒束孢的变化规律。经过1年宿存后，粉棒束孢的数量降低了99%以上，但是存活的粉棒束孢的活力基本保持在50%以上，虽然数量显著降低，但是若此时能遇到寄主昆虫，依然有能力侵染引起病害。作为中低温型真菌，高温不利于粉棒束孢的宿存，但是低温(-18 ℃)保存1年，宿存量基本维持在106个/g以上，毒力维持在90%左右。12 ℃土壤含水量低于35%，1年后的宿存量可保存104个/g以上，含水量45%～65%，1年后宿存量基本降低至103个/g以下，其毒力降低至80%以下。不同来源的土壤中微生物对粉棒束孢表现出不同的抑制作用，其中野外高山草甸土壤中微生物的抑制作用更为显著，不利于粉棒束孢的宿存，而室内饲养土壤由于幼虫排泄物、饲料腐殖质等更利于宿存和毒力的保存，这与调查结果基本一致，野外的冬虫夏草比室内培殖的冬虫夏草更少发生粉棒束孢病害。

冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫饲养的环境，相对适合粉棒束孢的宿存和毒力保存，这可能是粉棒束孢病害很难根治的原因之一。蝙蝠蛾幼虫饲养的微生态环境复杂，需要综合考虑多个因素的影响，其变化规律，对周围幼虫的影响及传播等还需要进一步的研究。明确其传播规律，才能在防控上做到有的放矢。在蝙蝠蛾幼虫饲养环境中防治粉棒束孢，需要充分考虑对其蝙蝠蛾幼虫的毒力影响，若能筛选到有效的拮抗菌株，作为生物防治菌将极大降低对蝙蝠蛾幼虫的危害。本研究结果也为粉棒束孢作为生防菌提供了参考。