赛罕乌拉自然保护区斑羚性激素水平的季节变化

张 蕊, 陈照娟, 姜秀丽, 王晓玲, 乌力吉, 孟和达来, 陈 琛, 韩莹莹, 鲍伟东

(1. 北京林业大学 生物科学与技术学院, 北京 100083; 2. 内蒙古赛罕乌拉国家级自然保护区管理局, 赤峰 025150； 3. 烟台市福山区高疃镇政府, 烟台 265505)

激素水平的高低一定程度上决定了动物生理状态，对于激素水平的检测往往可以有效地监测动物生理状态变化，在动物保护尤其是濒危野生动物的研究与保育中有着重要意义。但针对濒危野生动物激素水平的研究目前存在很多限制[1-2]，传统方式例如直接采血等方法，虽能准确获得野生动物的激素水平数据，但存在濒危野生动物数量稀少，捕获难度大，捕获过程中易对其造成伤害且易引发应激反应等限制。在此背景下发展而来的基于非损伤性取样的方法，虽然在激素水平数据的准确程度上不如传统的直接采血方法，但能够破除上述各种制约，获得激素水平的相对变化趋势，由此逐渐在野生动物激素水平研究中广泛应用[3-5]。

国内外基于非损伤性采样法对濒危野生动物的类固醇性激素开展了大量的研究[6-7]。在对神农架自然保护区内的川金丝猴(Rhinopithecusroxellana)种群进行的研究中，从粪便的保存方法及保存时效等角度探讨了野生川金丝猴的繁殖生物学特征、应激生理状态等[8]。利用放射性免疫分析法(radio immunoassays, RIA)及化学发光酶免疫分析法(solid-phase chemiluminescent enzyme immunoassay, SPCEI)对墨西哥坎佩切州的黑吼猴(Alouattapigra)种群的粪便性激素进行了调查研究，并比较了两种方法在测试皮质醇激素(cortisol)、睾酮(testosterone)、雌二醇(estradiol)及孕酮(progesterone)水平上的差异，结果表明两种方法在皮质醇激素和睾酮检测分析的有效性方面不存在差异，但放射性免疫分析法在检测雌二醇和孕酮结果上相对更好[5]。

中华斑羚(Naemorhedusgriseus)为偶蹄目(Artiodactyla)、牛科(Bovidae)、斑羚属(Naemorhedus)的国家二级重点保护野生动物，被列入国际自然与自然资源保护联盟(IUCN)《世界物种红色名录》近危级(NT)和濒危野生动植物物种国际贸易公约(CITES)附录Ⅰ中[9-10]。斑羚活动范围比较固定，常在密林深处的悬崖峭壁间活动，生性敏觉机警，一般单独或成小种群生活[11]。成年斑羚怀孕期为6～8个月，每胎产1～2仔，哺乳期为2个月，1.5～2岁时达到性成熟，寿命为13～18年[12-13]。目前国内外对于斑羚的研究多集中在生境选择、食性分析、家域分析、分子分析等方面[14-16]，但对其性激素季节性变化方面的研究还很少。本研究选择内蒙古赛罕乌拉国家级自然保护区的斑羚为研究对象，采用放射性免疫分析法(RIA)检测斑羚粪便样品中的睾酮、孕酮、雌二醇，关注该地区斑羚粪样激素水平的季节性变化趋势，并探讨造成变化的原因。

1 研究区域概况

赛罕乌拉国家级自然保护区位于内蒙古自治区赤峰市巴林右旗北部山地(118°18′～118°55′E，43°59′～44°27′N)，面积为100 446.1 hm2，其中核心区总面积为16 340.3 hm2，占保护区总面积的15.7%；缓冲区总面积33 750 hm2，占总面积的33.6%；实验区总面积为50 355.8 hm2，占总面积的50.7%。气候属于半湿润温寒气候，7月份最为炎热，最高气温29℃；1月份最为寒冷，最低气温-32℃。年平均降水量400 mm，多集中在6月份至8月份。自然保护区山高林密，能够涵养水源，沟谷河流较多，赛罕乌拉属大兴安岭南部山地的典型地段，北高南低逐渐向丘陵和平原过渡，由森林、灌丛过渡到草原和草甸植被，植物资源非常丰富。丰富的植物资源孕育了丰富的野生动物资源，也为斑羚提供了良好的生境[7]。

2 研究方法

2.1 斑羚粪便样品采集及处理

本研究采用非损伤性取样方法，基于前期预调查结果，通过样点法、样线法相结合的方式对研究区域所有适宜斑羚生存的地点进行搜寻采集。同区域分布的草食性动物除斑羚外，还有狍(Capreoluspygargus)以及东北马鹿(Cervusxanthopygus)，3种动物的粪便在颗粒大小、粪迹类型等方面差异较大，因此区分不同物种的粪便难度不大。样品采集时选取色泽鲜亮的新鲜粪便，采集10～20颗粪粒于一次性自封袋中，记录每份样品的采集时间、GPS位点、区域位置等信息，加入适量无水乙醇固定，存入-20℃条件中备用。本研究采样时间分别为2015年12月、2016年3月、5月、7月和9月，共采集到斑羚粪便样品共计554份，同时选用了2013年11月份采集的经分子方法鉴定已确定性别的样品，雌雄性样品各20份[11](表1)。

表1 斑羚粪便样品数量统计

本研究在综合考虑各种提取方法的优劣以后，采用李春等[18]的提取方法，并在实验过程中加以细微的优化，使之能够有效地适应斑羚的粪便样品，尽量做到有效便捷。具体步骤如下：

1)取粪便样品2～3粒于研钵中研碎，去除砂砾及粗纤维，取0.5 g于10 mL离心管中；2)加入4 mL甲醇与水的混合溶液(8∶1)，最大涡旋速度震荡混匀3 min；3)加入2.5 mL石油醚最大涡旋速度震荡混匀约1 min；4)室温条件下3500 r/min离心15 min；5)取甲醇层溶液1.5 mL于2 mL离心管中，至于-80℃条件下保存待测。

2.2 粪便中性激素的检测

斑羚粪样中睾酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E2)的检测选用北京北方生物技术研究所生产的碘[125I]雌二醇(E2)放射免疫分析药盒，产品批号分别为国药准字S10940093、国药准字S10940094、国药准字S19973002，检测工作由该公司利用XH-6010全自动智能γ免疫计数器完成,试剂盒检测后进行联机数据处理。

1)联机处理: 使用log-logit或四参数数据处理模式由电脑自动处理得出结果；2)百分结合率计算：设S0管计数为B0，各标准管或样品管计数为B，非特异管计数为NSB，则百分结合率计算公式为B/B0(%)=(B-NSB)/(B0-NSB)×100%；3)logit计算：各标准点或样品管的logit值计算公式为logit=ln[(B/B0)/(1-B/B0)]；4)计算器处理：使用有线性拟合功能的计算器，计算出样品浓度值；5)对同一时间即同一批次的样品浓度值计算批内变异系数CV(Coefficient of variation)，检测所得数据的有效性，批内变异系数CV(%)=(标准偏差SD/平均值Mean)×100%，<10%即认为所得数据为可靠有效数据可用作后续分析[19]。

2.3 数据处理

在检测这一步骤中，每份样品均检测了睾酮、孕酮及雌二醇3项指标，之后数据处理时采用雄激素(睾酮)与雌激素(孕酮+雌二醇)直接对比初步判定性别的方法，根据比对结果，将雄激素高的样品归为雄性，雌激素高的样品归为雌性，以此进行数据分析[20]。所得结果使用SPSS17.0分析，GraphPad Prism 7.0作图。

3 结果与分析

3.1 斑羚粪样中睾酮(T)的检测

将所有样品在数据比对之后初步判定性别的情况下，对疑似雄性的所有样品中的睾酮水平加以整理，由睾酮水平的变化趋势可知，2016年度睾酮水平峰值出现在7月,为(236.21+23.31)ng/g，水平最低值出现在3月，且3月至7月期间呈现上升趋势，随即7月出现下降趋势。2015年12月至2016年9月各时间段样品睾酮检测值批内变异系数CV分别为：2.40%、5.96%、9.66%、9.87%和8.9%，数据的有限性测定均在允许范围之内。2013年11月雄性个体粪便样品的检测结果，睾酮测值介于2016年7月与9月之间，相较于其他月份来看属于高位水平，且与2015年12月、2016年3月和2016年5月的测值差异显著(图1)。

图1 睾酮水平变化趋势

**表示与2013年11月样品相比差异极显著(P<0.01)；下同

3.2 斑羚粪便中孕酮(P)的检测

将所有样品在数据比对之后初步判定性别的情况下，对疑似雌性的所有样品中的孕酮水平加以整理，2016年度孕酮水平峰值出现在5月，为(398.24+39.11)ng/g，显著高于其他各点(Mann-Whitney检验，P<0.05)。水平最低值出现在3月，且3月至5月期间呈现上升趋势，随即5月之后出现下降趋势。2015年12月至2016年9月各时间段样品孕酮检测值批内变异系数CV分别为：9.79%、9.58%、9.82%、9.77%和8.91%，数据的有限性测定均在允许范围之内。2013年11月雌性个体粪便样品的孕酮测值与2016年12月相当，与其他月份相比处于低位水平。与2016年5月、7月和9月的测值差异显著(图2)。

3.3 斑羚粪便中雌二醇(E2)的检测

由孕酮水平的变化趋势将所有样品在数据比对之后初步判定性别的情况下，对疑似雌性的所有样品中的雌二醇水平加以整理，2016年度孕酮水平峰值出现在3月，为(36.36+3.18)ng/g，显著高于其他各点(Mann-Whitney检验，P<0.05)。水平最低值出现在7月，且3月至7月期间呈现下降趋势。2015年12月至2016年9月各时间段样品雌二醇检测值批内变异系数CV分别为：8.47%、8.75%、9.84%、9.81%及9.89%，数据的有限性测定均在允许范围之内。2013年11月雌性个体粪便样品的雌二醇测值与2016年12月相差不大，同样处于低位水平。与2016年3月的测值差异显著(图3)。

图2 孕酮水平变化趋势

图3 雌二醇水平变化趋势

4 讨论

4.1 斑羚粪便性激素变化趋势

动物性腺激素产生和代谢直接影响着生殖系统的功能运转，与动物繁殖状态密切相关。睾酮在雄性动物繁殖行为中起重要作用，而雌二醇及孕酮在雌性动物繁殖活动的启动和维持中起重要作用，是雌性发情的基础。在孕激素及雌激素的共同作用下，雌性动物通过协同和拮抗两种调节途径调控其生殖生理活动[21-25]。

对于斑羚这一物种的性激素水平研究，目前可供参考的文献资料寥寥无几，仅见在泰国清迈对当地圈养的8只雄性中华斑羚(Naemorhedusgriseus)的雄激素、肾上腺糖皮质激素水平的季节性变化研究[26]。该研究发现，圈养条件下斑羚的雄激素雨季(5月16日至10月15日)和冬季(10月16日至翌年2月15日)的水平明显高于夏季(2月16日至5月15日)，且雄激素代谢水平与温度与日长成明显的正相关关系；另外，对于该区域雌性斑羚的繁殖周期及相应的发情行为的研究发现，雌性斑羚的发情周期季节性不强，发情周期约为21 d，妊娠期约为7个月，雌性个体在此期间不动情时间约为2～5个月，并且在交配期间翘尾行为会随着雌激素的升高而明显加强[27]。此外，国内对于圈养条件下的斑羚属物种赤斑羚(Naemorhedusbaileyi)也有少量研究，谢燕对上海动物园繁殖期的赤斑羚的行为节律变化与对应的性激素水平进行了初步相关性分析，并没有对赤斑羚整年度性激素水平变化情况进行监测[28]。以上研究均受圈养条件限制，虽然在样品采集及雌雄性和个体判定上具有一定的优势，但是动物的激素水平变化受多方面因素影响，如温度、光照、食物等，相同的物种在不同的地点或者相同的地点不同的年度往往出现差异。这些研究虽然能够提供一定的关于斑羚繁殖过程的信息参考，但对于野外自然条件下斑羚的繁殖生理情况具有的参考价值还需要深入探讨。

赛罕乌拉自然保护区志中记载，该地区斑羚发情期于每年10月，翌年春季4—5月份左右产仔[17]。本研究中斑羚体内睾酮水平虽然在7月份出现峰值，但是9月份睾酮水平与2013年11月份的睾酮水平差异不显著，所以9月份睾酮水平处于一个高水平状态，一定程度上与上述记载一致。针对7月份出现峰值或许可以从3点原因来解释：其一，7月份正处于亚成年个体快速发育的时期，睾酮在雄性个体中主要起到第二性征的形成和维持、精子发生的起始和维持、雄性性欲的维持等作用，因此雄性个体的睾酮水平在此期间出现较高水平。其二，雄性动物体内的睾酮水平受温度干扰较大，有些动物在温度较高的情况下体内睾酮水平会出现峰值，这在灵长类及啮齿类动物中已有相关结论[29-30]。赛罕乌拉地区2016年7月份温度较高，斑羚体内的睾酮水平极有可能随温度升高而出现峰值。其三，对普氏原羚(Procapraprzewalskii)粪便中皮质醇激素的保存失效进行了研究，结果表明普氏原羚粪便在-20℃下保存50 d不至引起皮质醇含量的变化，但在野外暴露超过24 h的样品会造成测定结果产生误差[31]。7月保护区夏季，气温炎热，不利于粪便在野外状态下的保存，本次研究所采样品相对都比较新鲜，但是不能完全保证所有的粪便样品均为24 h内采集的，所以7月份的数据可能存在一定的误差，导致出现峰值。

孕酮在雌性个体中主要起到促进生殖道发育、调节发情、维持妊娠的作用，且低水平的孕酮含量可以促进发情，但高水平的孕酮含量却能对抗雌激素的作用，阻止子宫敏感和抑制发情。孕酮水平的高低一定程度上受食物资源和营养状况的影响，在我国西北及内蒙古地区，若遇灾年牧草状况不好时，妊娠母山羊胎盘分泌的孕酮较低，导致流产率偏高[32]。斑羚体内孕酮水平峰值出现在5月，且3月至5月急剧升高而后至7月出现缓慢下降，这可能是食物资源、妊娠状态等多种原因综合影响的结果，这种变化趋势一定程度上印证了当地文献中所记载斑羚的产仔时间。此外，孕酮除上述维持妊娠等作用外，在哺乳期间也需要较高水平以维持正常的生理功能。

雌二醇在动物体内主要起到诱导发情行为、维持动物性兴奋及促进生殖道发育的功能。斑羚体内雌二醇水平在3月出现峰值，7月份水平最低，这一点恰好与同时期的孕酮水平形成对比，因为较高水平的孕酮可与雌二醇形成拮抗作用，抑制发情，此结果也与泰国相关研究中提及的斑羚妊娠期间不动情持续时间较长的结论类似[27]。

4.2 选取2013年粪便样品对比研究的必要性

本研究中对于斑羚粪便性激素水平的分析中，选取了2013年11月的样品对其中的3项激素水平进行了测试，这部分样品已经做过性别鉴定[11]，对其激素水平进行检测，主要出于以下两个方面的考虑。

其一，此前并没有对该地区斑羚的性激素水平的相关研究，该区斑羚性激素的变化情况究竟如何需要本研究提供资料参考。但在野外自然条件下，无法对采样对象的性别进行辨别，本研究亦假设在样品性别未知的情况下对斑羚性激素水平的整体变化情况进行探索，所以需要一部分已知性别的样本数据进行参考。

其二，通过对2013年样品中性激素水平的检测，我们了解到，粪便样品虽不及血液样品能够精准地反应斑羚体内的生理状况，但是由于采样便捷、储存容易的特点给研究工作带来极大便利，同时斑羚的粪便样品在保存了近3年之后其中的激素水平依然能够检测得到，这给后续的研究工作提供了新思路，可以尝试采集对应月份的样品做一次保存时效的对比分析。

4.3 试验方法的改进

本研究在进行伊始即假设在忽略样品性别的条件下对所有采集到的样品检测3项性激素水平，直接分析各项指标的月度变化趋势。后期处理数据时发现，无法通过这种方式获得良好的结果，容易造成对该区斑羚繁殖生理状态的理解偏差。随后采用将孕酮及雌二醇两项测值与睾酮测值对比的方式来初步判定性别，假定雄激素(睾酮)高则表明样品为雄性，雌激素(孕酮+雌二醇)高则表明样品为雌性，以此依据来分析数据，得出如上结论，在一定程度上解决了野外自然条件下无法直接判定样品性别的瓶颈。同时如果想要更加精准的验证此方法的可行程度，需要利用分子生物学技术来确定样品性别后再进一步探讨。对于利用放射性免疫分析法的超微量分析检测粪样性激素浓度各时间段的相对值，可免去提取率低以及样品中残留的有机溶剂对试剂盒标记抗原与抗体特异性结合产生影响的担忧[33]。

综上所述，通过采集斑羚粪便，利用放射性免疫分析法检测其中的性激素，进而研究斑羚性激素季节变化的方法具有可行性强、可靠性高、对动物不构成伤害等优点，是一种比较理想的实验方法，但是在采集的时候也应该严格注意粪便的新鲜程度，应保证采集的粪便为24 h内的新鲜粪便，避免后续的测量结果产生误差。