刘成海：雷公藤制剂致肝损伤毒理机制系列研究初步揭晓

文图/《中国医药科学》记者 费 菲

雷公藤在临床中常作为国内首选的免疫抑制剂之一，用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病等疾病。近年来，随着雷公藤应用的增多，有关肝毒性报道也逐渐增多。2012年，在原国家食品药品监督管理局药品评价中心发布的一期关于雷公藤制剂用药安全问题的通报中，雷公藤制剂引起的药物性肝炎被列为典型病例。因此，在雷公藤的实际运用中，如何保证疗效并尽可能地降低其毒副反应受到越来越多的关注。上海中医药大学肝病研究所所长、上海中医药大学附属曙光医院肝硬化科主任刘成海教授用系列研究初步阐释了雷公藤制剂致肝损伤的临床特点和毒理机制。

刘成海教授介绍，目前药物性肝损伤发病率呈上升态势，成为继病毒性肝炎、脂肪肝之后，发病率排第三位的肝损伤。肝损伤是雷公藤常见不良反应，雷公藤甲素是其主要效应与毒性物质。性味归经：苦、寒、大毒；雷公藤是常用的中草药，传统的典籍记载其功能主治为祛风除湿，活血通络，消肿止痛。适应症为类风湿关节炎、肾小球肾炎、红斑狼疮、皮肌炎等。现代药理学研究认为雷公藤具有免疫抑制（抑制T淋巴细胞）、抗感染、抗炎、抗过敏、抑制血管通透性等作用。雷公藤对于风湿免疫性疾病有良好的疗效，用于治疗关节炎、皮肌炎（DM）和肾病等。另一方面，雷公藤亦具有生殖毒性等不良反应。国家药品不良反应监测中心2004～2011年9月报告的70余例药物不良反应，主要有药物性肝损伤、肾功能不全、粒细胞/白细胞/血小板减少、闭经等。常用药有雷公藤片、雷公藤多甙片、金关片。

雷公藤致肝损伤的临床特点

通过综合文献分析和临床回顾性资料分析，刘成海教授归纳了雷公藤制剂所致肝损伤的性别、年龄和基础疾病等特点，肝损伤类型与临床表现，以及治疗措施及预后等。雷公藤制剂所致肝损伤的文献多为个案报道，共计17名患者，与预期差距较大（或因检索局限/未报道）。基线资料：17例患者22～66岁，平均年龄为42.4岁，男性患者7例，女性患者10例。基础疾病包括类风湿关节炎7例、慢性肾病4例、关节痛3例、其他3例。从病例特点看，女性患者略多于男性，基础疾病多为类风湿性关节炎，由于对改善蛋白尿疗效明显，慢性肾病的治疗较多应用雷公藤制剂。

上述文献显示，17例患者的用药剂量不等，雷公藤片剂 ＜60mg/日，10例患者用药至发病时间为6天至1年不等（3例30天左右发病，2例60天左右发病）；雷公藤草药（15g～100g），煎剂，5例患者用药至发病为5小时至4天，其中3例死亡，2例用药前饮酒；雷公藤合剂剂量与用药至发病时间不详2例（患者死亡）。从用药情况与主要临床表现来看，临床症状表现以消化道的症状较为明显，还表现为皮肤损害和泌尿系统损害。具体如下：尿少、肢面水肿、胸闷、头晕2例；腹痛、腹泻3例；肝区不适、皮疹、皮下瘀斑、皮肤瘙痒、水泡、发热、厌油腻、肌肉酸痛、黑便、腰痛1例；纳差、呕吐、尿黄（茶色）6例；恶心4例；黄疸5例；乏力8例。

从生化病理特点与治疗预后情况看，患者首次发病时肝功能异常，转氨酶的变化参差不齐，中位数达到500U/L左右。17例患者中有13例患者谷丙转氨酶（ALT）升高，9例患者谷草转氨酶（AST）升高，中位数达到250U/L左右，总胆红素（TBIL）升高，中位数150umol/L左右。

4例死亡病例肝脏病理结果显示，肝细胞脂肪变性或淤胆，致死原因并非肝衰竭，而是心肌或肾损害。使用的保肝抗炎的药物，包括还原性谷胱甘肽、甘草酸二胺、清开灵、地塞米松等。1个月左右临床症状均减轻或消失、肝功能好转或痊愈后出院。5例患者在抢救治疗无效后死亡，其中2例患者的死亡与药物无关，3例与疾病相关。

文献分析结果显示，雷公藤引起肝损伤多见于中老年关节病患者，男女患者比例差距小。临床表型为肝细胞损害型，表现以乏力、消化道、皮肤损害为主。雷公藤中成药制剂常规剂量肝损伤轻重不一。肝组织病理（尸检观察）以肝细胞脂肪变性为主，死亡原因多与肝脏损伤无直接相关。上述文献报道较少，都是散在的个案报道，未能进行因果关系的评价，证据的级别相对较低。

雷公藤致肝损伤毒理机制的系列研究

刘成海教授在上海中医药大学附属光华医院风湿免疫科进行了单中心的调查。回顾性的调查共纳入80位患者进行分析。患者基线资料：肝功能异常的患者在男女年龄、性别无大的差异,男性42例（52.5%）vs.女性38例（47.5%）。患者基础疾病以类风湿关节炎、强直性脊柱炎、关节痛、反应性关节病、痛风性关节炎、干燥综合征、银屑病性关节炎、结缔组织病、炎性脊椎病为主，还有其他皮肤疾病，包括银屑病等。

药物使用情况较为多样，包括单独制剂和复方制剂：雷公藤多苷片25例（31.2%）、昆仙与多苷片22例（27.5%）、昆仙胶囊20例（26.2%）、昆仙与逐痛颗粒7例（8.8%）、逐痛颗粒4例（5.0%）、多苷片与逐痛颗粒1例（1.3%）。患者联合用药主要包括类风湿关节炎治疗用药（免疫抑制剂、消炎止痛的制剂）：白芍总苷31例（19.6%）、美洛昔康23例（14.6%）、甲氨喋呤片22例（13.9%）、甲泼尼松龙19例（12.0%）、乌梢祛风片10例（6.3%）、洛索洛芬钠片9例（5.7%）、青霉胺片8例（5.1%）、羟基氯喹片6例（3.8%）、沙利度胺片6例（3.8%）、正清风痛宁片5例（3.2%）、瑞巴派特片5例（3.2%）、来氟米特片5例（3.2%）、塞来昔布5例（3.2%）、非布司他片5例（3.2%）。

上述80例患者肝功能指标升高幅度不是非常高，谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、总胆红素（TBIL）等主要肝功能指标为正常值上限（ULN）的2倍左右。其中，雷公藤多苷片应用后，谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）明显升高；昆仙胶囊应用后，肝红素明显升高；昆仙胶囊与雷公藤多苷片同时用时，总胆汁酸（TBA）明显升高。

按照海氏法则（Hy's Law）评估严重肝损伤的临床病例应满足以下3项条件：药物达到引起肝细胞型损伤，患者血清ALT（或AST）升高≥3×ULN；患者同时出现血清TBil升高＞2×ULN，但无胆道阻塞的证据（血清ALP升高）；可排除其他导致血清ALT（或AST）和TBil同时升高的原因；由此可见，雷公藤制剂并未达到严重的肝损伤程度，其影像学表现主要为脂肪肝、胆囊炎症的变化。

不同雷公藤制剂肝损伤患者生化指标改变结果显示，胆囊壁毛糙38例（27.5%）、轻度脂肪肝22例（15.9%）、中重度脂肪肝9例（6.5%）、胆囊炎9例（6.5%）、胆囊结石6例（4.3%）、胆囊息肉6例（4.3%）、肝囊肿6例（4.3%）、胆固醇结晶5例（4.3%）、肝硬化1例（0.7%）、脾大 3例（2.2%）、胰腺0例、肾结晶 19例（13.8%）、肾囊肿11例（8.0%）、肾结石3例（2.2%）。

对于80例肝功能异常患者的常用治疗药物主要如下：益肝灵48例（35.8%）、阿拓莫兰24例（17.9%）、异甘草酸镁16例（11.9%）、优思弗8例（6.0%）、复方甘草酸苷4例（3.0%）、胆宁片2例（1.5%）、多烯磷脂酰胆碱1例（0.7%）。治疗后患者预后大多良好。

以上单中心临床调查的结果显示，雷公藤制剂致肝损伤的患者人群以中老年关节病患者为主，无明显性别差异。不同雷公藤制剂所致肝功能异常存在差异，但大多表现为轻中度转氨酶升高。患者用药的情况较为复杂，联合用药较多。在有限的病例里影象学检查肝脏多为脂肪性改变，肝硬化等慢性病变少见。刘成海教授认为，这些肝功能异常的患者都有较为明显甚至严重类风湿关节炎的病痛，大多数患者为联合用药，可在继续使用或减少免疫抑制剂剂量的情况下使用保肝的药物。

为探究雷公藤致肝损伤的毒理机制，刘成海教授建立了小鼠动物模型进行研究。他设计了两种给药方式，一种是急性肝损伤模型，一次性大剂量灌胃雷公藤甲素（1000μg/kg），每只小鼠给药约 0.2mL，24h后处死；另一种是慢性肝损伤模型，小剂量给药4周连续灌胃雷公藤甲素（500μg/kg），每日给药一次，每只小鼠给药约0.2mL。结果显示，大剂量急性的单次给药后，雷公藤甲素肝损伤小鼠组织学表现的肝损伤较为显著，出现明显的肝组织肝细胞凋亡坏死。持续给药的方式每次剂量是一次性给药量的一半，但给药时间长达4周，总体给药量更大，反而未出现十分明显的肝脏组织学病变信息。

初步的观察发现，雷公藤甲素肝损伤小鼠的血清生化改变的特点，急性染毒小鼠血清ALT、AST、AKP、TbilB变化明显，慢性染毒小鼠血清ALB变化明显。可以假设这些慢性肝损伤模型动物对于毒性已发生了适应性变化。即生化学的特点显示，急性给药带来的肝损伤更为明显，而慢性给药对肝损伤而言相对更轻，出现了适应性恢复。

在雷公藤甲素对体外初步的细胞性实验中，小鼠肝细胞植株给予 12.5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L 等不同剂量的雷公藤甲素，在12h、24h、48h等不同时间进行孵育后，观察雷公藤甲素对体外培养的肝细胞毒性的量效与时效关系，可以看到雷公藤甲素可以抑制肝细胞株的活力，一定程度上受到浓度的影响，但时间依赖性更为明显。对培养细胞进行了生物指标测定，选择一定剂量经12小时孵育后发现，雷公藤甲素（12h/50nM）可以促进肝细胞的凋亡。再进一步看到，对肝细胞细胞色素C的释放也有促进作用，这提示雷公藤甲素可能与激活线粒体凋亡途径导致细胞凋亡明确相关。

对雷公藤甲素进行肝毒性血清代谢组学分析，分别采集正常组和雷公藤模型组血清，采用UPLC-Q/Exactive液质联用仪进行代谢组学分析。结果表明，雷公藤甲素致肝损伤与胆汁酸代谢，甲硫氨酸代谢、糖皮质激素和炎症反应有关，其中3-O-5β-胆汁酸、四氢皮质醇、五亚甲基甲硫氨酸和花生四烯酸在雷公藤甲素组明显升高，呈现出一定的特征性变化。

研究结果显示，雷公藤甲素在体外可以诱导干细胞的凋亡机制，影响线粒体的结构功能，促进细胞生物C的释放，通过线粒体途径来影响肝细胞的凋亡。初步总结雷公藤毒理机制认为，雷公藤甲素单次急性、或多次慢性给药，均可导致小鼠肝损伤，但急性损伤肝组织病变明显，慢性给药似乎出现适应性恢复。肝损伤模型小鼠具有胆汁酸代谢等特征。雷公藤甲素可诱导体外肝细胞凋亡的机制与影响线粒体结构功能、促进释放细胞色素C有关。

刘成海教授表示，他关注雷公藤制剂主要是出于两点原因，一是雷公藤是常用中药，无论是作为饮片还是制成中成药，雷公藤制剂在临床上是有效的，但必须注意其在有效的同时也产生毒性。二是雷公藤作为免疫抑制剂广泛用于类风湿性关节炎、肾病综合征等疾病的治疗。雷公藤作为一种免疫抑制剂在引起肝损伤的机制上可能有一定的特殊性。因此需要进一步研究的问题很多，比如，患者基础疾病及联合用药对雷公藤肝毒性有何影响？雷公藤急性、慢性肝损伤有哪些临床特征？雷公藤肝毒性的物质基础及其生物标志物有哪些？雷公藤肝损伤的关键作用机制是否基于线粒体途径的适应性免疫调节？

最近，在上海市中医药发展办公室的支持下，刘成海教授新立了一项大规模的课题，针对几个有代表性的药材进行回顾性队列研究和前瞻性研究对比，其中包括雷公藤导致的肝损伤。观察组收集了300例服用雷公藤制剂导致肝损伤的病例（n=300），对照组则是相同疾病服用同种制剂不发生肝损伤的病例（n=300），治疗与随访观察48周，收集观察组患者的基本资料、临床诊疗信息、影像资料、生化指标等，同时收集对照组的可疑药物留置、临床信息及较重要的生物样本（血液、尿液、肝组织等）进行临床特点以及相关机制的研究，包括药物代谢与生物标志物的研究。随访 0周、4周、8周、12周、24周、36周、48周，共7个时间点。观察组的肝损伤临床特征与预后治疗方法，对照组的生物样本库、药物代谢与生物标志物。同时探索基于线粒体的雷公藤免疫调节肝损伤机制。

刘成海教授总结，初步的观察和文献分析发现，雷公藤制剂所致肝损伤多表现为肝细胞损伤型，基础疾病多与类风湿关节炎等自身免疫性疾病有关。雷公藤最主要的活性成分之一雷公藤甲素可诱导小鼠肝损伤，其部分机制与调节细胞色素C及其线粒体结构功能、促进肝细胞凋亡有关。雷公藤肝损伤的临床特点、生物标志物与适应症免疫相关毒理机制等尚需要大力研究。

现场提问：对于免疫抑制剂雷公藤肝损伤机制，您目前是否已经找到关键性的研究方法？

刘成海教授：这是我们一直疑惑的问题，也是难点的问题。因为这种雷公藤免疫调节会涉及两个方面，很复杂，可以说是“按下葫芦浮起瓢”，就像当前肿瘤治疗领域涌现了一批单克隆抗体,如免疫检查点抑制剂（PD1/PD-L1），实际上这些药物也明显引起了肝功能损伤。另外，中药与免疫的关系很密切，除了雷公藤甲素对T细胞免疫功能的抑制作用以外，还有其他免疫领域的作用，现在我们还未明确，只开展了初步研究。雷公藤甲素对T细胞免疫功能的抑制作用还有待于今后的研究。西药的免疫抑制剂也有肝损伤的报道，免疫抑制剂为什么又会导致肝损伤？这些都是非常难的课题。

专家小传

刘成海，主任医师，上海中医药大学“学术荣誉体系”讲席教授、曙光医院首席研究员、博士生导师。上海中医药大学肝病研究所所长、上海市中医临床重点实验室主任、上海中医药大学附属曙光医院肝硬化科主任。擅长治疗慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝、自身免疫性肝病、肝癌等的中西医结合治疗。教育部“新世纪优秀人才”、全国卫生系统先进工作者。