延展显微镜成像技术及其应用

陈凯 张英春 赵关芳

摘 要 传统光学显微镜由于光学衍射极限的限制，其分辨率不足，难以观察亚细胞显微结构。自超分辨显微技术提出以来，在细胞膜蛋白等单分子成像中得到广泛运用，并于2014年获得诺贝尔化学奖。但这些超分辨技术多通过减少或避免处在激发体积内的分子同时发射荧光来突破光学衍射。作为一种新型超分辨手段，延展显微镜具有成像时间短、可标记密集生物大分子等优势。本文介绍了延展显微镜的成像原理和特点，对其在亚细胞结构、神经生物学等领域的应用进行了综述，并对其发展前景进行了展望。

关键词 延展显微镜; 超分辨成像; 凝胶; 评述

1 引 言

目前，显微镜已经成为生命科学研究必不可少的工具。随着研究的深入，许多亚细胞结构需要更高分辨率的显微镜。然而，点光源通过透镜成像时，由于光学衍射会形成光斑，当两个点光源之间的距离很小时，其光斑会重叠，无法成像。因此，光学显微镜的分辨率存在极限。早在1873年德国物理学家Abbe就预言了光学显微镜的分辨率存在极限[1]，传统光学显微镜的分辨率在横向（垂直于光传播方向）上可达到250 nm，轴向（平行于光传播方向）可达到550 nm[2]，而许多亚细胞结构小于此分辨率尺度，因此，研究细胞器、膜蛋白等结构还需要分辨率更高的显微镜。

荧光是分子在特定波长下吸收光（激发光）并发射出较长波长光（发射光），基于此可成像。超分辨荧光显微镜是通过改变分子的激发光或发射光，进而突破光学衍射极限的光学成像技术的总称。超分辨荧光显微成像技术在纳米级别的微小结构以及生物大分子检测等研究中发挥了重要的作用[3]。目前，超分辨荧光成像技术主要分为两类： 一类是基于模式照明的超分辨荧光显微镜，包括受激发射损耗显微镜（Stimulated emission depletion，STED）[4，5]、结构光照明显微镜（Structured illumination microscopy，SIM）[6，7]和可逆饱和光学线性荧光跃迁显微镜（Reversible saturable optical fluorescence transitions，RESOLFT）[8]; 另一类是基于单分子定位的超分辨荧光显微镜，包括随机光学重构显微镜（Stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）[9]和光激活定位显微镜（Photoactivated localization microscopy，PALM）[10]。

基于模式照明的超分辨荧光显微镜主要原理（以STED为例）为： 处于激发态的荧光分子既可通过自发荧光辐射过程以荧光的形式释放能量回到基态，也可通过受激荧光辐射过程产生与外界辐射的频率、位相、偏振相同的辐射但不发出荧光。STED利用以上效应叠加， 使周边区域的荧光分子淬灭，只有中心荧光分子发光，从而突破衍射极限[4，11]。目前，对于生物样品，使用有机染料时，STED分辨率可达20 nm; 使用荧光蛋白染料时，分辨率也可达到50～70 nm[2]。

基于单分子定位的超分辨荧光显微镜利用单分子荧光成像的定位精度进行超分辨成像。通过对距离较近的荧光分子分别激发，使得单个荧光分子的光斑互不影响，实现对单个分子的精确定位，并将多次成像的结果进行重构， 从而得到超分辨圖像[12]。

由于超分辨荧光显微技术具有非侵入性、动态表征以及分辨率高的优点，目前已广泛应用于生命体内生化反应、调控机制、生物大分子结构等研究[3]。但随着研究的进一步深入，这些超分辨荧光显微技术仍存在一定的局限性，例如多次成像拟合会使时间分辨率受到限制，细胞内生物大分子分布密集而无法对特定物质进行标记染色。2015年，Chen等[13]提出了延展显微镜（Expansion microscopy，ExM），可有效提高时间分辨率和空间分辨率。ExM是依托凝胶吸水膨胀将生物样品中衍射极限内的荧光分子距离增大的一种新型超分辨荧光显微技术，其分辨率至少可达到70 nm。

2 延展显微镜技术成像原理及优势

ExM是利用特定荧光标记方法将用于表征生物信息的荧光信号共价连接到可吸水膨胀的凝胶上，之后凝胶扩展时，光学衍射极限内的荧光分子彼此远离的超分辨成像显微技术。其原理如图1[13]所示。使用特制的标记物将表征生物信息位置的荧光分子与凝胶共价连接，当凝胶遇水扩展时，荧光分子的距离也随之变大，之后再利用激光共聚焦显微镜等光学显微镜观察扩展后的生物样品。与之前的超分辨成像方法相比，由于不涉及多次采集重构等过程，可显著提高时间分辨率。此外，扩展后的生物样品其生物分子的密度显著降低，对于复杂的密集生物结构，延展显微镜可更清晰地成像。ExM操作包括标记、凝胶化、消化、扩展以及固定成像等步骤。

2.1 标记

传统抗体染色和基因编码的荧光蛋白经过延展显微镜中凝胶、消化步骤后，荧光消失，无法成像。因此，ExM使用的标记物除常规抗体之外，还需要特定的物质使荧光分子与凝胶相连。最初，ExM使用偶联核苷酸链的抗体和三功能团标记物（图1A）共同标记，其中，三功能团标记物包括参与聚合凝胶的甲基丙烯酰基、与抗体上偶联核苷酸链可互补杂交的寡聚核苷酸片段以及用于显色的荧光团[13]。该三功能团标记物既可特定靶向生物分子，也可与凝胶聚合物连接。通过一抗、偶联寡核苷酸链的二抗以及三功能团标记物先后特异性识别生物样品后（图1B和1C）[13]，样品生物信息“转移”到凝胶上，凝胶上的荧光信号即可表征生物信息。同时使用不同标记物可对生物样品进行多色成像，观测多种物质的分布。

除了上述标记方法外，目前，6-丙烯酰氨基己酸琥珀酰亚胺酯（AcX）[14]、甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS）[15]等化学物质也被用于延展显微成像。这些物质既可与氨基反应，同时也可参与凝胶。生物样品经抗体标记后，使用上述化学物质处理可实现传统的免疫染色与延展显微镜兼容。

2.2 凝胶化

ExM使用的凝胶（图1D）多是丙烯酰胺单体和交联剂N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酸钠三者在引发剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺的作用下， 通过自由基聚合而成的三维多孔网状结构[13]。过硫酸铵在水溶液中能产生SO24，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基之后，与丙烯酸钠和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺聚合形成凝胶。四甲基乙二胺的游离碱基可促进过硫酸铵形成SO24。不同浓度的N，N'-亚甲基双丙烯酰胺会影响凝胶扩展倍数[16]，浓度越大， 扩展倍数越小; 但浓度过小时，凝胶易断裂，影响实验操作[17，18]。当N，N'-亞甲基双丙烯酰胺的浓度为0.15%（w/w）时，凝胶在去离子水中可达到45倍的线性扩展，且不影响实验操作[13]。此外，Truckenbrodt等[19， 20]提出的×10 ExM利用N，N-二甲基丙烯酰胺（DMAA）和丙烯酸钠作为单体，经过硫酸钾和四甲基乙二胺催化形成聚合物凝胶[21]，其在水中可达到10倍的线性扩展。

2.3 消化

经凝胶扩展后的生物样品能否正确反映生物信息的相对位置是ExM的关键。为保证生物样品各向同性扩展， ExM需使用非特异蛋白酶消化处理水凝胶和生物样品形成的复合物，使其在扩展过程中各方向作用力相近，避免生物样品相对位置的变化以及“伪影”的产生。Tillberg等[14]的研究表明，相比于赖氨酰肽链内切酶（LysC）和高压灭菌锅处理，蛋白酶K消化能够更好地表现样品原始的生物信息。由于内源性生物信息已被破坏，样品中待测分子的空间关系保持不变，定量检测误差约为1%～4%。

2.4 扩展

经消化后的生物样品凝胶复合物在水溶液中吸水胀大，即扩展过程。该步骤可使衍射极限距离内的荧光分子之间的距离增大，进而实现超分辨成像。凝胶的扩展倍数除了与凝胶单体溶液浓度相关外，还与扩展溶液存在一定的关系。由于凝胶内外的渗透压差，消化后的凝胶在去离子水中可达到最大的扩展倍数[22]。更换3～5次水，可使凝胶的膨胀体积稳定，可增加100倍。扩展后的凝胶网络结构如图1E所示，经扩展后的样品成分99%是水[14]，颜色透明，方便成像。

2.5 固定和成像

成像过程中，若将扩展后的凝胶置于普通玻片上会发生漂移的现象，严重影响成像。为了减少成像过程中凝胶的漂移，特别是长时间成像的实验，需要将扩展后的凝胶固定于玻片上。目前，常用的固定方法有聚赖氨酸修饰玻片、琼脂糖包埋及强力胶粘合。利用聚赖氨酸和凝胶之间相反电荷的吸附作用，可使扩展样品附着于玻片上。与之相比，琼脂糖和强力胶固定可形成不透明界面，进而引入光学散射，因此不能应用于倒置光学显微镜，但其附着力较强，可使样品在数天内稳定成像[23]。

扩展后的生物样品通过显微镜进行成像，目前使用较多的是宽场荧光显微镜和共聚焦显微镜，经过4.5倍线性扩展，ExM分辨率可达到60～70 nm[24]。

3 延展显微镜的发展

自Chen等[13]于2015年提出ExM概念以来，目前主要有3种不同的ExM[24]： 蛋白保留延展显微镜（Protein retention ExM， ProExM）用于细胞间或细胞内信号蛋白的分布研究，使用免疫染色，凝胶体积膨胀可达100倍（各方向扩展4.5倍）[14，15]; 原位杂交延展显微镜（Expansion fluorescent in situ hybridization，ExFISH）用于RNA结构以及纳米级RNA位置的研究，由于杂交缓冲液的限制，其可引起各方向3倍的膨胀[25，26]; 迭代延展显微镜（Iterative ExM，iExM）通过对样本进行两次扩展，以获得更高分辨率，体积膨胀可达10000倍，分辨率可达到25 nm[27]。

3.1 ProExM

ProExM通过化学试剂AcX等将标记生物样品的抗体、链霉亲和素或者荧光蛋白等与凝胶连接，致使抗体上的荧光信号在凝胶扩展之后仍可保留50%以上，从而实现免疫染色与ExM兼容。

针对不同的染色要求，根据AcX处理的顺序将ProExM可分为三类[14]： （1）生物样品经固定、免疫染色后，使用AcX处理，再进行凝胶化、消化、扩展成像等步骤，主要用于免疫染色的细胞和组织成像; （2）生物样品表达荧光蛋白后固定，使用AcX处理，之后进行凝胶化等步骤，主要用于转染荧光蛋白的生物样品; （3）生物样品经固定后，使用AcX处理，经过凝胶化、温和的匀浆程序（如碱性水解变形或LysC消化）和扩展之后进行免疫染色，主要适用于扩展前排列紧密的组织或生物大分子。

除AcX外，Chozinski等[15]使用MA-NHS或GA对免疫标记的生物样品进行处理，使免疫染色可用于ExM。MA-NHS既具有连接蛋白质的基团，也有与ExM三功能标记物相同的甲基丙烯酰基。GA既可与细胞上的氨基作用，也可与凝胶中氨基作用。

3.2 ExFISH

细胞内RNA的结构等信息对于分析细胞类型和解析表达谱具有重要作用。单分子荧光原位杂交（Single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）技术是测定RNA拷贝数以及空间定位的有效方法，但目前只能在单细胞中同时检测10～30种RNA。Moffitt等[28]提出的Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization（MERFISH）技术，可鉴定单细胞中数千种RNA的拷贝数和空间定位，进而分析与蛋白质相关的RNA分布以及预测基因功能。但是，在细胞中，RNA分子之间相互重叠，致使高丰度RNA多重成像受到限制。

ExFISH是通过Label X等化学物质将RNA共价连接到凝胶上，利用ExM中凝胶扩展降低RNA密度，再进行RNA单分子荧光原位杂交检测的技术。

Label X可由Label-IT Amine 和AcX合成，既可与RNA中鸟嘌呤N7反应，也可参与凝胶[26]。Label X共价连接凝胶的方法，在确保大多数RNA至少与凝胶有一个连接点的同时，会使大多数RNA中多处与凝胶共价连接，在扩展过程中，RNA可能会被拉伸。另一种将RNA共价连接到凝胶的方法是利用Acrydite修饰的poly-dT寡核苷酸链，既可与mRNA的polyA尾部杂交，也可与凝胶共价连接。Wang等[25]利用该寡核苷酸链将MERFISH技术和延展顯微技术联用，显著提高可测量RNA的密度。对人骨髓瘤细胞（U-2 OS）中的高丰度RNA进行MERFISH成像，检测效率接近100%。ExFISH可用于观察单个mRNA分子的位置以及其与蛋白质的分布，这对研究神经信号传导以及基因表达调控具有重要作用。

3.3 iExM

传统的ExM由于单体溶液等的限制，最多可实现4.5倍的线性扩展，iExM通过两次凝胶扩展过程，将生物样品进行双倍膨胀，可达到约20（4.5 × 4.5）倍的线性膨胀，有效分辨率约25 nm。iExM的成像原理如图2所示[27]： 生物样品（图2A）第一次凝胶（图2B）过程选用了在碱性条件下可裂解的交联剂N，N'-（1，2-二羟基乙烯）双丙烯酰胺（DHEBA），消化扩展（图2C）后，被常规交联剂N，N'-亚甲基双丙烯酰胺形成的凝胶再次包埋（图2D），经碱性溶液切割之前的凝胶后，进行二次扩展（图2E）。在第一次凝胶过程中，不含荧光团但可与二抗上寡核苷酸链A'互补杂交的功能团标记物I参与凝胶（图2F和2G），经蛋白酶消化扩展后，利用含有荧光团的三功能标记物Ⅱ进行标记（图2H），并进行二次凝胶（图2I），碱性条件裂解第一次凝胶后再次扩展（图2J）。其中， 三功能标记物Ⅱ中的寡核苷酸序列A'（与二抗上偶联的寡核苷酸链序列相同）和功能团标记物I中的寡核苷酸序列A可互补配对，从而使生物信息可通过二次凝胶上的荧光团加以表征。经过两次扩展，原本距离较近的生物分子彼此远离。iExM成像与扩展前STORM成像之间的误差很小，约为测量长度的2.5%。iExM对于细胞的畸变约为9 nm，组织为13 nm。经iExM两次凝胶扩展后的生物样品可在荧光显微镜下解析小鼠大脑突触结构，分析单个突触连接问题[27]。

4 延展显微镜的生物学应用

研究生物大分子在细胞、组织中的分布可为生化反应、细胞间信号传导以及细胞功能等研究提供重要的信息，ExM作为新型超分辨手段，已被应用于生物学研究的不同领域。

4.1 ExM在亚细胞结构研究中的应用

细胞的微管对于细胞器和生物大分子的分布和功能起着重要的组织作用，通常作为光学显微镜分辨率判断的依据。利用ExM可对细胞中微管清晰成像，分辨率至少可达到70 nm。

Chen等[13]对HEK 293细胞中的微管进行成像（图3A～3D），对图3D中虚线（沿微管垂直）方向的荧光强度定量分析图中曲线进行高斯拟合，可得到（83.8±5.68） nm的半峰全宽，该半峰全宽可表征ExM成像的有效分辨率。此外，通过ExM也可观察到网格蛋白涂层的凹坑（图3E和3H），相比超分辨结构光照明显微镜（Super-resolution structured illumination microscopy，SR-SIM）成像（图3F，3G）更为清晰[13]。Tillberg等[14]根据ProExM步骤对细胞、组织等生物样品进行扩展，使用共聚焦显微镜对扩展后HeLa细胞的遗传编码具有荧光团的融合蛋白进行成像，微管蛋白的半峰全宽可达67 nm，表明分辨率可达到70 nm; 同时，对网格蛋白和角蛋白双色成像证实该方法可用于研究多种蛋白之间的位置关系。Chozinski等[15]对扩展后的PtK1细胞有丝分裂时期成像可观察到动粒纤维微管束和染色体附着于纺锤体上，对扩展后的BS-C-1细胞内质网和线粒体成像显示， 内质网与两个线粒体紧密并置。利用激光共聚焦显微镜可观察到iExM扩展的BS-C-1细胞微管的空心结构[23]。

4.2 ExM在神经生物学研究中的应用

神经回路中的生物大分子以及细胞间连接对于生物体正常生命活动具有至关重要的作用，研究脑组织中生物分子的分布以及突触结构，对于治疗疾病等具有重要作用。ExM也被用于解析小鼠海马体等神经元之间的突触连接，观察神经递质受体、突触支架蛋白以及神经递质合成酶等蛋白的分布[29～32]。

Chen等[13]对表达遗传编码荧光蛋白的扩展后脑组织成像，发现突触前膜Bassoon以及突触后膜Homer1分布于CA1腔隙分子层树突棘（图4A～4D），并且经ExM扩展后的脑组织在共聚焦显微镜下成像时，二者可清楚地区分（图4E和4F）。Tillberg等[14]利用ProExM成功揭示了小鼠、果蝇、斑马鱼脑中的突触结构，以及人类癫痫患者脑标本中血管附近的星形胶质细胞间隙连接，在对经ProExM扩展后的完整哺乳动物脑组织表达的荧光蛋白成像时，可清晰观察到树突状脊柱形态，以及薄的脊柱颈部。Chozinski等[15]对扩展后的THY1-YFP-H小鼠脑组织成像，可清晰地观察到突触和树突棘之间的连接。

4.3 ExM在其它领域中的应用

除了用于研究蛋白质的结构和功能、细胞与细胞之间的相互作用外，ExM也被用于RNA等物质的成像。Chen等[26]对长链非编码RNA进行成像，观测到了NEAT1 lncRNAs清晰的环形形态以及lncRNA XIST灭活X染色体的图像（图5A～5E）。扩展后的小鼠脑组织样品，在宽视野显微镜下可清晰观测到YFP mRNA定位于YFP荧光细胞，谷氨酸脱羧酶1（Gad 1）mRNA定位于皮层和海马的特定层中具有特征性排列的细胞群，在共聚焦显微镜最大放大倍数下，可观测到单个转录产物，达到单分子精度，在3 h内，即可完成575 μm × 575 μm × 160 μm组织样品的测量。Wang等[25]对U-2 OS同时利用ProExM标记钙粘蛋白和MERFISH标记RNA的实验证实，二者可兼容，不会影响彼此的实验结果。哺乳动物细胞中存在数以万计的RNA，延展显微技术将RNA彼此分离，降低密度，可显著提高单个细胞中RNA测量的种类。而MERFISH和proExM的联用，可在单细胞中同时进行转录组学和蛋白质组学的测定。

5 總结与展望

目前，ExM已经实现与传统免疫染色兼容，通过改变凝胶单体、交联剂的种类和浓度可达到10倍的线性扩展，通过2次凝胶扩展可达到20倍的线性膨胀，分辨率逐步提高。将ExM和SIM两种超分辨技术联用，对人类病原体贾第虫的细胞骨架成像，证实其在超高分辨水平下的各项同性扩展，两种超分辨技术联用可使空间分辨率达30 nm [33，34]。然而，对于其它的超分辨技术，如单分子定位显微镜，其与ExM联用还存在诸多问题： 凝胶扩展过程中使轴向厚度增加，超过了油镜成像的高度，影响成像精度; 基于单分子定位的超分辨荧光显微镜特殊的成像缓冲溶液会对凝胶的扩展产生影响，导致扩展倍数变小; 现有的染色标记方法对于扩展后的样品标记密度较低[35，36]。而且，随着分辨率提高，探针[37]的大小也将成为阻碍成像分辨率提高的主要因素。此外，ExM研究多处于技术证实阶段，主要对已知形态的细胞微管蛋白以及脑组织结构等成像[38～41]，而对于其它亚显微生物学样品[42]的成像研究甚少。随着研究深入，ExM依靠其时间分辨率以及减小生物信息密度等优势，将被应用于越来越多的单分子成像。

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