温肾养血方对高龄雌鼠卵泡发育的作用及其对PI3K-AKT-FOXO3a通路影响的研究

辛明蔚 张 莹* 何军琴 杨 维 武 颖 尹晓丹 贾朝霞

(1．首都医科大学附属北京妇产医院中医科，北京 100026;2．首都医科大学附属北京妇产医院群体保健科，北京 100026)

卵巢功能是决定女性生育能力的重要因素，但是随着社会进步、工作紧张、压力加大，卵巢储备功能下降的发病率逐年增高且越来越年轻化。卵巢储备功能下降主要表现为卵巢皮质内原始卵泡数量过早耗竭，不能产生足够多的卵母细胞或者卵母细胞质量进行性下降，导致激素分泌异常及生育力下降，且流产率和胚胎非整倍体率增加[1-2]。因此揭示卵巢功能减退的机制，建立有效的治疗方案，已成为日益增加的临床需求。近年来，研究[3-4]显示中医药在促进卵泡发育、提高妊娠率及降低西药的不良反应等方面具有优势，但其作用机制亟待阐明。本研究借助现代医学有关本病发病机制的认识及检测手段，观察温肾养血方促卵泡发育的作用机制，探索中西医结合治疗高龄女性不孕症的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

中药饮片购自北京同仁堂股份有限公司。温肾养血方为首都医科大学附属北京妇产医院赵松泉主任医师研制的经验方，其组成为柴胡、香附、木香、赤芍、泽兰、益母草、牛膝、鸡血藤、红花、丹参、当归、川芎、蒲黄、熟地、淫羊藿、山茱萸、菟丝子、枸杞子、覆盆子、鹿角、羌活、细辛、肉苁蓉等。中药在首都医科大学中医药学院中药制剂实验室制备，水煎后浓缩成药液，4 ℃冰箱储存备用。孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)，购自以色列Prospec公司，货号：HOR-272；人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)，购自以色列Prospec 公司，货号：P139079。

1.2 试验动物及分组方法

(1)实验动物：8月龄ICR小鼠体质量40 g，购于北京斯贝福实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0002。采用随机数字表法将小鼠随机分为A组：空白组0.9%(质量分数)氯化钠注射液；B组：控制性超排卵组(controlled ovarian hyperstimulation,COH)组；C组：温肾养血方低剂量组(16.75 g/kg)；D组：温肾养血方中剂量组(33.5 g/kg)；E组：温肾养血方高剂量组(67 g/kg)，灌胃药物剂量为0.2 mL，每组16只。

1.3 给药方法及取材方法

连续每日定时(下午6时)灌胃给药10日，第11天对B、C、D、E组雌鼠同时腹腔注射PMSG 10 IU/只，A、B组雌鼠同时注射等量0.9%(质量分数)氯化钠注射液，48 h后，腹腔注射HCG 10 IU/只，14 h后,剖腹取出小鼠卵巢及输卵管，以无菌TB针轻轻划破输卵管壶腹部收集卵丘复合物，立即以80 IU/mL的透明质酸酶处理卵丘复合物，剔除卵母细胞周围的卵丘细胞，用吸卵管反复吹打后，对去除颗粒细胞的卵母细胞在显微镜下记数，进行形态学观察，并计算每只小鼠超排卵数和优质卵泡数。

1.4 生育质量观察指标

在给药前及给药期间每天记录每只小鼠的体质量，进行统计学分析。记录小鼠的卵母细胞数量和优质卵泡数量。优质卵泡判定标准：卵母细胞形状周正，边缘清晰、平滑，细胞内部均匀透亮。每组记录4只雌鼠与雄鼠交配后的产仔数量。

1.5 qRT-PCR法检测小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA的表达

将卵巢组织置于0.9% (质量分数)氯化钠注射液的DEPC水中，采用电动组织研磨器低温研磨，采用动物组织总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，DP431)提取RNA，采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生化科技有限公司，KR106)进行反转录，然后采用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒(北京天根生化科技有限公司，FP205)进行qRT-PCR反应：在20 μL体系中加入 12.5 μL PCR Mix上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，置于荧光定量PCR仪中(ABI7300)，95 ℃ 5 min 预变性，95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，在72 ℃采集荧光信号，共40个循环，最后72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCT法计算PI3K、AKT和FOXO3a mRNA的相对表达量。引物序列：PI3K：上游：5′-CCACGACCATCTTCGGGTG-3′；下游：5′-GGGGAGTAAACATTCCACTAGGA-3′；AKT：上游：5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′；下游：5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′；FOXO3a：上游：5′-ATGGCAGAGGCACCAGCC-3′，下游：5′-CAAAGCTGGGTACCAGGCTGA-3′ (由苏州鸿讯生物科技有限公司合成)。

1.6 Western blotting法检测小鼠卵巢PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a蛋白表达

取-80 ℃保存的卵巢组织，经冰冷的PBS 充分洗涤后置入玻璃匀浆器中，然后加入预冷的蛋白裂解液研磨成匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液，-80 ℃保存。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，每个泳道上样 100 μg。浓缩胶80 V电泳20 min，分离胶120 V电泳2 h；然后100 V恒压转膜 1.5 h至PVDF膜。5%(质量分数)脱脂奶粉/TBST室温封闭1 h。4 ℃孵育一抗过夜，二抗(1∶5 000 稀释)37 ℃ 1 h。TBST 洗膜3次，每次10 min，发光液曝光30 s～5 min，凝胶成像系统对条带进行采集和分析。

1.7 免疫组织化学法检测卵巢组织中PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a蛋白表达

取卵巢组织，浸泡于10%(体积分数)甲醛固定，再先后进行脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤制备组织蜡块；然后经切片、脱蜡、水化、热修复，3%(体积分数)H2O2溶液阻断，加抗体(PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a抗体浓度均为 1∶200)，加生物素化山羊抗小鼠 IgG(兔)，DAB 显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化、返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。高倍镜下(400×)随机选取5个视野，Image J软件测量阳性区域平均吸光度值，取5个视野的平均值作为所测指标的蛋白表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 温肾养血方对小鼠体质量的影响

各组小鼠体质量变化见表1。给药过程中，温肾养血方对各组小鼠体质量没有明显影响，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 排卵数及生育结果

B组、C组、D组和E组的排卵数和优质卵泡数均明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.01)；C组和D组的排卵数和优质卵泡数均明显高于E组，差异有统计学意义(P<0.01)；不同给药组小鼠的生育个数趋势与排卵数和优质卵泡数变化的趋势相一致，C组和D组的生育数均高于E组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表1 各组小鼠体质量的变化Tab.1 Body weight changes in different groups of mice

A:blank group;B:controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

表2 不同给药组小鼠排卵及生育结果Tab.2 Number of follicle and high quality follicle in different administration groups of mice

*P<0.01vsgroup A;#P<0.01vsgroup E.A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

2.3 温肾养血方对ICR小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA水平的影响

由图1可知，与A组比较，D组PI3K mRNA的表达下降，在C、E组的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；B组、C组AKT mRNA的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；B、C、D、E组的FOXO3a mRNA表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，随着中药浓度升高，FOXO3a mRNA表达的含量逐渐下降。

2.4 温肾养血方对ICR小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路蛋白水平的影响

与A组相比，D组的P-PI3K、PI3K表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，E组和A组相比差异无统计学意义(P>0.05)；B组和C组P-AKT、AKT表达水平升高，随着温肾养血方给药浓度的上升，逐渐下降接近空白组水平；P-FOXO3a、FOXO3a在B组、C组、D组表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，并有随着给药浓度的增加逐渐降低的趋势，详见图2。

2.5 免疫组织化学检测温肾养血方对ICR小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路的影响

小鼠卵巢中磷酸化和非磷酸化的PI3K和FOXO3a的蛋白表达水平变化趋势与qRT-PCR法和Western blotting法检测结果基本一致。与A组相比，D组的P-PI3K、PI3K表达量均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；C组和E组与A组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与A组相比，B组P-AKT的表达量明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)；D组P-AKT的表达量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；C组和E组与A组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与A组相比，B组和E组AKT的表达量明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)；C组和D组与A组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与A组相比，B组、C组和D组P-FOXO3a、FOXO3a的表达量均明显上升，差异均有统计学意义(P<0.05)；E组与A组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表3，图3～8。

图1 温肾养血方对小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA水平的影响Fig.1 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on PI3K,AKT,FOXO3a mRNA level in mouse ovaries

*P<0.01vsgroup A;A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:middle dose group;E:high dose group.

表3 温肾养血方对小鼠免疫组织化学结果的影响Tab.3 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on immunohistochemical results of mice

*P<0.05,**P<0.01vsgroup A.A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:middle dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

图2 温肾养血方对小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路蛋白水平的影响Fig.2 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on the protein levels of PI3K-AKT-FOXO3a pathway in mouse ovaries

*P<0.05vsgroup A;A:blank；B: controlled ovarian hyperstimulation；C:low dose；D:mid dose；E:high dose.

图3 ICR小鼠卵巢P-PI3K免疫组织化学染色结果Fig.3 Results of ICR mouse ovarian P-PI3K immunohistochemistry(200×)

A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group.

图4 ICR小鼠卵巢PI3K免疫组织化学染色结果Fig.4 Results of ICR mouse ovarian PI3K immunohistochemistry(200×)

图5 ICR小鼠卵巢P-AKT免疫组织化学染色结果Fig.5 Results of ICR mouse ovarian P-AKT immunohistochemistry(200×)

图6 ICR小鼠卵巢AKT免疫组织化学染色结果Fig.6 Results of ICR mouse ovarian AKT immunohistochemistry(200×)

3 讨论

中医学认为高龄卵巢储备功能下降的主要原因在于肾。肾藏精，主生殖，“两精相博，合而成形”，胚胎的形成依赖于男女双方的先天生殖之精。卵母细胞是能否成功受孕的一个决定性的因素。女子又以肝为先天，肝藏血，肝肾同源，精血互生。张俊博等[5]基于聚类分析对高龄女性不孕症的中医证候规律进行了探讨，结果显示，高龄女性不孕症基本病机以肾虚、血瘀为主。女性进入“五七”之后，生殖能力逐渐下降，肾精渐衰。肾精不足而则肝血不充，肝肾精血亏虚日久而致气虚，气虚无力推动血液的运行，而致血瘀，血瘀日久而新血不生，不足以濡养卵泡。本研究中温肾养血方以温肾填精、活血养血为治法，熟地、肉苁蓉、鹿角、淫羊藿等为滋补要药，滋肾阴补肾阳，阴阳并补；菟丝子、枸杞子、覆盆子、山茱萸等肝肾同补，配伍柴胡、香附、红花、丹参、川芎、当归、赤芍、益母草、泽兰、鸡血藤蒲黄等疏肝行气、活血养血之品，全方阴阳气血并补，兼行气活血，使本固血充，气畅血行，促进卵泡的发育，从而改善卵巢功能。

图7 ICR小鼠卵巢P-FOXO3a免疫组织化学染色结果Fig.7 Results of ICR mouse ovarian P-FOXO3a immunohistochemistry(200×)

图8 ICR小鼠卵巢FOXO3a免疫组织化学染色结果Fig.8 Results of ICR mouse ovarian FOXO3a immunohistochemistry(200×)

PI3K-AKT 信号通路与细胞增生、分化密切相关，在卵母细胞和颗粒细胞中均存在完整的 PI3K-AKT 信号系统，它们共同调节着卵泡的生长发育、成熟和排卵，能预测卵母细胞质量[6]。在卵母细胞中，PI3K-AKT 信号通路对于卵泡的激活具有阶段特异性，对始基卵泡的发育起决定性作用[7]，可调控始基卵泡的发育和生长、颗粒细胞的增生和分化等过程[8]。PI3K可引起AKT蛋白磷酸化，活化后的AKT可通过调控线粒体蛋白释放和细胞周期等途径促进细胞增生、分化和抗凋亡。因此，PI3K信号通路的活性以下游的P-AKT 表达水平为代表。AKT的功能与PI3K相似，可刺激细胞生长。本研究结果显示COH组和低剂量组P-AKT的蛋白表达水平高于其他组，之后随着温肾养血方给药浓度的上升，P-AKT蛋白表达水平恢复至接近空白组水平；AKT mRNA的表达水平在中药低剂量组最高，温肾养血方能调控高龄小鼠PI3K、P-PI3K和AKT、P-AKT的含量。

FOXO家族成员是PI3K-AKT通路的主要效应蛋白，PI3K-AKT通过作用于FOXO蛋白上的磷酸化位点来控制其活性，影响FOXO下游一系列与细胞增生、凋亡及周期阻滞相关基因的表达[9]。Schneider等[10]发现FOXO3a基因可能是抑制原始卵泡过度活化的重要调控因子，可以避免鼠原始卵泡过度耗竭、延长卵巢储备和生育能力[11-12]，其持续表达会导致卵母细胞及卵泡发育迟缓，从而显著减少卵母细胞体积[13]，而降低FOXO3a基因表达却能增加鼠静息卵巢储备[14-15]。当某些分子作用卵泡后，PI3K通路激活，使FOXO3a磷酸化，磷酸化的FOXO3a进入胞质，失去活性，卵泡开始发育。本研究结果显示在COH组中P-FOXO3a和FOXO3a的表达量最高，显著高于空白组，随着中药组给药浓度增加，P-FOXO3a和FOXO3a的表达量逐渐降低，FOXO3a在高剂量组则降至接近与空白组的水平，表明温肾养血方可以通过调节FOXO3a的表达量提高卵巢储备功能、促进卵泡发育。

综上所述，以上结果初步证明了温肾养血方能够促进高龄雌鼠卵泡发育，增加排卵数、优质卵泡数及生育数量，其作用机制可能与调节PI3K、AKT和FOXO3a的表达有关。温肾养血方低剂量和中剂量效果最好，高剂量次之，可能与中药浓度增加同时调控了其他相关因子的表达有关，其具体机制仍需进一步探讨。