清热生肌膏治疗大鼠深ＩＩ度烫伤试验研究

王发斌 赵晓翔 王波 邓强 黄韵蓓 李嘉兰 刘瑞

摘要：研究清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面的保护作用及作用机制。将SD大鼠100只随机分成模型组、烧伤膏组、清热生肌膏高剂量组、清热生机膏低剂量组。模型组及治疗组采用烫伤仪持续烫伤大鼠股部8 s制成深Ⅱ度烫伤模型，伤后立即给药，每天1次，连续21 d，不同的时间点取材，测定创面的创面愈合率、组织含水量、血管内皮生长因子（VEGF）、羟脯氨酸（Hyp）、血清白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）含量。结果表明，清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烧伤具有良好的保护作用，其作用机制和增加创面VEGF、Hyp水平，降低血清IL-1、TNF-β含量有关。

关键词：清热生肌膏;深II度烫伤;血管内皮生长因子（VEGF）;羟脯氨酸（Hyp）;血清白细胞介素-1（IL-1）;肿瘤坏死因子-β（TNF-β）

中图分类号：R285.5         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）01-0091-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.01.022           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Experimental Study on the Treatment of Deep II Degree Scald

in Rats by Qingre Shengjigao

WANG Fa-bin1，ZHAO Xiao-xiang2a，WANG Bo2b，DENG Qiang2a，HUANG Yun-bei2a，LI Jia-lan2a，LIU Rui2a

（1.Guiyang No.5 Vocational School，Guiyang 550018，China;2a.School of Chemistry and Life Sciences;2b.Teaching Laboratory Management Center，Guizhou Education University，Guiyang 550018，China）

Abstract： The protective effect and mechanism of Qingre Shengjigao on deep second degree scald wound in rats were studied. 100 SD rats were randomly divided into model group， burn cream group， high dose group of Qingre Shengjigao， and low dose group of Qingre Shengjigao. In the model group and the treatment group， the model of deep scald in the femoral part of the scald rat was made by the scald instrument， and the model of deep second degree scald was made by 8 s. Immediately giving medicine after injury， 1 times a day for 21 days， and taking samples at different times， the wound healing rate， water content， vascular endothelial growth factor（VEGF）content， hydroxyproline（Hyp）content， interleukin-1（IL-1） content， tumor necrosis factor beta（TNF-β）content were determined. The results showed that， Qingre Shengjigao has a good protective effect on deep two degree burn in rats， and its mechanism is related to the increase of VEGF and Hyp levels and the decrease of serum IL-1 and TNF- β levels.

Key words： Qingre Shengjigao; deep second degree scald; vascular endothelial growth factor（VEGF） ; hydroxyproline（Hyp）; interleukin-1（IL-1）; tumor necrosis factor beta（TNF-β）

燒烫伤一般是指由于热力如蒸气、火焰、炽热金属、沸水和高温气体等所致体表组织损害。烧烫伤程度分为Ⅰ度、浅Ⅱ度、深Ⅱ度、Ⅲ度[1]。西药在烧烫伤治疗过程中运用广泛，疗效也十分显著，但存在一些明显的不良反应[2]。中药治疗轻、中度烧烫伤的效果良好，中药制剂不仅剂型丰富[3]，还具有药源丰富、配制简单、无不良反应、价格低廉、疗效显著等特点[4]。中医对烧烫伤采用清热解毒、益气理脾、养阴生津、脱里排脓、活血化瘀原则。清热生肌膏是由黄连、黄柏、黄芩、三七和冰片等中药组成的复方中药制剂，本试验观察清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面的保护作用及作用机制，以期为清热生肌膏的进一步开发提供依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验动物  普通SD大鼠100只，雌雄各半，体重300～500 g，普通级，购于重庆唯康公司。单只分笼，自由进食、饮水，室温饲养。

1.1.2  药品与试剂  水合氯醛（AR）、九水合硫化钠（AR）、75%的乙醇、购自贵阳市医药公司，湿润烧伤膏购自汕头市美宝制药有限公司，批号1312403A。高浓度清热烧伤膏（含生药2 g/mL）、低浓度清热生肌膏（含生药1 g/mL）自制。

血管内皮生长因子试剂盒、羟脯氨酸试剂盒、白细胞介素-1试剂盒、肿瘤坏死因子-β试剂盒均购自上海心语生物科技有限公司。

1.1.3  试验仪器  YLS-5Q台式恒温恒压烫伤仪（济南益延科技发展有限公司）;电热干燥箱（嘉兴市远航环保教育仪器有限公司）;CP-6800电推剪（深圳科德士电器有限公司）;HEIDOLPH DI-AX900 型匀浆机（德国）;Sigma 3-18 型台式高速冷冻离心机（德国）。

1.2  试验方法

1.2.1  深Ⅱ度烧伤模型的建立及给药  将100只大鼠随机分为4个组，进行一周的适应性饲养，大鼠单笼饲喂，编号。随机分为模型组、高剂量组、低剂量组和烧伤膏组。大鼠称重，10%水合氯醛按0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射进行麻醉[5]。剃大鼠股骨上端两侧的毛涂10%硫化钠，3 min后擦拭，去除毛根。将烫伤仪接通电源，温度调到80 ℃，致伤压力为烫伤棒自重500 g，烫头面积为4 cm2，烫伤时间设为8 s，调整好动物的体位及烫伤部位皮肤平整度，烫伤棒垂直与皮肤表面接触，烫伤仪倒数计时器自动开始计时，计时结束时，迅速将烫伤棒撤离皮肤表面，为深Ⅱ度烧伤[6]。烫伤后涂药，每个创面约0.1 g，每天给药一次。

1.2.2  创面组织指标检测

1）创面愈合率。分别在烫伤后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天5个时相点，从每组大鼠中各取5只，用透明方格纸描绘出创伤面积，以伤后第1天面积作为烫伤面积，以数方格的方法得出创伤面积，创面愈合率=（烫伤面积-各时相点面积）/烫伤面积×100%。

2）组织含水量。分别在烫伤后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天5个时相点，从每组大鼠中各取5只，麻醉，创面剪下，滤纸吸干血迹，电子天平称量湿重，于80 ℃烘干48 h。组织含水量=（烘干前质量-烘干后质量）/烘干前质量×100%。

3）血管内皮生长因子、羟脯氨酸测定。取创面全层皮肤100 g左右，滤纸吸去血迹，加入生理盐水研磨，在4 ℃以下10 000 r/min离心15 min，取上清液-20 ℃以下保存。分别于第1天、第3天、第7天、第14天、第21天5个时相点从每组大鼠中各取5只采取大鼠样本，按试剂盒使用说明书检测。

4）白介素-1、肿瘤坏死因子β含量。大鼠麻醉，大鼠心脏取血，静置2 h，3 000 r/min离心20 min，取上层清液，-70 ℃超低温保存。分别在第1天、第3天、第7天、第14天、第21天取血液，每次5只大鼠，按试剂盒使用说明书检测。

1.3  数据分析

试验结果用平均值±标准差（x±s）表示，SPSS 21.0进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著，具有统计学意义。

2  结果与分析

2.1  清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合率的影响

清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合率的影响见表1。以烫伤后第1天的创面为烫伤面积，从表1可以看出，第3天时，用药组创面愈合率呈上升趋势，随着用药时间的延长，第7天、14天和第21天，与模型组相比，差异明显。清热生肌膏高剂量组在烫伤后的第7天和第14天时与模型组相比有极显著差异，表明清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤后的愈合率有明显的促进作用。

2.2  清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面组织含水量的影响

清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面组织含水量的影响见表2。从表2可以看出，大鼠在烫伤后的第1天，用药组与模型组相比，创面组织含水量偏小，但并不太明顯。第3天时，清热生肌膏高剂量组和湿润烧伤膏组的创面组织含水量显著下降。第7天、第14天和第21天，各用药组创面组织含水量与模型组相比差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）。

2.3  清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度组织创面血管内皮生长因子的影响

清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度组织创面血管内皮生长因子的影响见表3。从表3可以看出，大鼠在烫伤后的第1天，用药组与模型组相比，血管内皮生长因子含量提高，但差异不显著。第3天、第7天、第14天和第21天，清热生肌膏高剂量组和湿润烧伤膏组血管内皮生长因子增加，与模型组相比差异极显著（P<0.01）。清热生肌膏高低剂量组血管内皮生长因子含量与模型组相比差异不显著。

2.4  清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度组织创面羟脯氨酸含量的影响

清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度组织创面羟脯氨酸含量的影响见表4。从表4可以看出，大鼠在烫伤后的第1天，用药组与模型组相比，羟脯氨酸含量升高，但差异不显著。第3天、第7天、第14天和第21天，清热生肌膏高剂量组和湿润烧伤膏组的羟脯氨酸含量增加，且与模型组相比差异极显著（P<0.01）。清热生肌膏低剂量组创面羟脯氨酸含量与模型组相比有增加趋势，但差异不显著。

2.5  清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫白介素-1含量的影响

清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤白介素-1含量的影响见表5。从表5可以看出，烫伤第1天，用药组与模型组相比，白介素-1含量降低，差异显著（P<0.05或P<0.01）。第3天、第7天、第14天和第21天，清热生肌膏高剂量组和湿润烧伤膏组的白介素-1含量降低，与模型组相比差异极显著（P<0.01）。清热生肌膏低剂量组白介素-1的含量与模型组相比有降低趋势，但差异不显著。

2.6  清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤肿瘤坏死因子-β含量的影响

清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤肿瘤坏死因子-β含量的影响见表6。从表6可以看出，烫伤后的第1天、第3、第7天、第14天和第21，清热生肌膏高剂量组和烧伤膏组与模型组相比，肿瘤坏死因子-β含量下降，差异极显著（P<0.01）。清热生肌膏低剂量组肿瘤坏死因子-β含量第14天和第21天与模型组差异极显著（P<0.01）。

3  小结与讨论

临床上深Ⅱ度烫伤作为常见的烧伤类型，采用大鼠深Ⅱ度烫伤模型为研究对象来探讨其作用机制。烫伤动物模型以小鼠、大鼠为主，动物烧伤模型面积和深度不容易控制，动物烧烫伤模型一般以烫伤为宜。烫伤方法有沸水直接烫伤、蒸汽烫伤、火焰烧伤、仪器烫伤、其他方法烫伤等。仪器烫伤具有烫伤温度、压力及作用时间可以精确控制及重复性好等优点，本试验采用仪器烫伤法，以大鼠为试验动物模型。

创面愈合是一个比较复杂的生物学过程，大致可将其分为炎症反应期（2～4 d）和增殖修复期（3～20 d）。炎症反应期是创面愈合的起始阶段，也是创面修复的必要途径，而炎症反应时间过长则会影响创面的修复，形成“难愈创面”[6]。当皮肤被烫伤后，因为炎症反应和微循环通透性的增加，会导致体液渗出和组织水肿，使皮肤的含水量明显增加，因此，通过测定创面组织含水量便能间接反映炎症反应的程度。淤滞带微循环障碍的转归决定着烧伤局部损伤程度，如果微循环淤滞加重，血栓形成增多，造成局部组织缺血缺氧，影响细胞代谢，加重组织损害，使创面加深;如果微循环改善，阻止血栓形成，则可局部损伤减轻，范围缩小，故减轻烫伤后局部组织水肿，对促进创面早期愈合有重要意义[7]。选择5个时相点探讨清热生肌膏的治疗作用，试验结果显示，清热生肌膏高剂量组第3天开始到第21天能显著降低组织含水量，降低水肿程度，缩短水肿时间。从创面愈合率的指标观察来看，烫伤后的第7天到第21天，药物组的创面愈合率明显提高，表明清热生肌膏对创面具有良好的保护作用。

血管内皮生长因子（VEGF）是一种血管再生的重要调控因子，它能够刺激血管内皮细胞迁移、增殖，该因子同时是一种局部的、内生性调节剂，其作用可维护血管的完整性及血管的正常生理状态[8]。VEGF是加速新生血管形成的重要细胞因子，也是作用最强、特异性最高的一种因子[9，10]，在创伤修复和组织重建中起着重要作用。清热生肌膏高剂量组在第3天、第7天、第14天和第21天显著提高血管内皮生长因子水平。表明在创面修复过程中，清热生肌膏烫伤膏可提高血管内皮生长因子含量，加强恢复血管的完整性及血管的生理状态，从而促进创面的愈合。

胶原是肉芽组织中细胞间质的主要成分，构成胶原的α-肽链，富含羟脯氨酸，羟脯氨酸的含量反映胶原在创面中的含量，从而评估创面愈合情况[11]，从烫伤组织羟脯氨酸含量来看，第3天、第7天、第14天和第21天，清热生肌膏高剂量组和湿润烧伤膏组的羟脯氨酸含量增加，与对照相比差异极显著。在创面修复过程中，清热生肌膏烫伤膏可提高羟脯氨酸含量，增加胶原合成，从而促进创面的愈合。

烫伤后白介素-1、TNF-α等在全身炎症反应中起着主导作用，机体所产生高浓度的TNF-α、IL-1、IL-6等炎症介质，一方面与炎症细胞相互作用，加重局部炎症反应;另一方面，高浓度的 TNF可激活细胞因子级联反应，进一步诱发炎症介质的释放[12]炎症介质的大量释放必然会导致剧烈的全身炎症反应，使机体进入“脓毒症状态”，在这种状态下，引发炎症反应失控，从而发展到不可逆转的多器官功能障碍综合征阶段。因此，检测 TNF-α、IL-1等炎症介质的水平变化有助于评估创面愈合情况。肿瘤坏死因子分为两种，既TNF-α和TNF-β，二者具有很相似的生物学性质，在烫伤研究中，对TNF-β检测较少。在烫伤后的第1天，用药组与模型组相比白介素-1含量明显降低。第3天、第7天、第14天和第21天，清热生肌膏高剂量组白介素-1含量降低。大鼠在烫伤后第1天、第3天、第7天、第14天和第21天，清热生肌膏高剂量组肿瘤坏死因子-β含量显著下降，表明清热生肌膏能减少血清中TNF-β、IL-1等炎症介质的合成和释放，控制炎症反应，减轻对创面的损伤。

清热生肌膏主要由黄连、黄芩、冰片、地榆、没药、三七等组成，具有清热解毒、活血化瘀、生肌等功效。清热生肌膏对大鼠深Ⅱ度烫伤具有较好的治疗效果，能不同程度提高烫伤后的创面愈合率，降低组织含水量，减轻烫伤后的炎症反应，对创面修复有较好的保护作用。其机制与增加烧伤创面组织VEGF合成和释放、促进创面微血管生成、降低烫伤大鼠血清TNF-β、IL-1水平等有关。

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