澳洲坚果油微乳体系的构建

涂行浩 张帅中 唐景华 杜丽清 帅希祥 张明

摘  要  为扩大澳洲坚果油应用领域，构建了澳洲坚果油微乳体系。以微乳区面积为评价指标，采用伪三元相图法，并结合单因素试验和Box-Behnken试验，对表面活性剂、助表面活性剂种类及用量和制备温度进行优选，并对相图中O/W型微乳中心区域的两条可稀释线上靠近中心的两个微乳液配方的粒径测定，评价微乳稳定性。澳洲坚果油微乳液较佳的制备工艺为：吐温60 （Tween 60）与聚氧乙烯氢化蓖麻油（PEG-40）质量比2.5为混合表面活性剂、聚乙二醇400（PEG400）与澳洲坚果油质量比3.5为混合油相、制备温度60 ℃，可制备出微乳区面积较大，无色透明并可无限稀释的微乳液，试验得到SME为13.61%。微乳液在长期贮存和大量稀释过程中，粒径变化较小，稳定性较好。

关键词  澳洲坚果油;微乳区面积;Box-Behnken试验;粒径;稳定性

中图分类号  TS201.2     文献标识码  A

澳洲坚果（Macadamia integrifolia）是一种原产于澳大利亚的树生坚果，也叫夏威夷果，因其果仁风味独特、营养丰富以及经济价值高特点，被誉为“干果皇后”。现已在我国热带地区广泛种植，初步统计种植面积已超过150 hm2[1-2]。澳洲坚果果仁中含油70%～80%，且80%以上的脂肪酸是单不饱和脂肪酸，主要以油酸（约60%）和棕榈油酸（约20%）为主，并含有大量生育酚和角鲨烯等活性成分，具有较高的保健价值及功能特性[3-4]。精制的澳洲坚果油呈淡黄色，除作为功能油脂食用外，还可用于高档化妆品制造的原料[5]。特别是其脂肪酸组成和与皮脂类似，易于吸收，使它有利于作为皮肤护理产品以及抗衰老面霜的关键成分[6-7]。另外，多项研究表明，澳洲坚果油在预防癌症[8]、降低炎症[6]和降低胆固醇[9]等方面具有较好的功效。

澳洲坚果油作为一种功能性油脂，受限于其水溶性的影响，市面上产品形式较为单一。为提高澳洲坚果油的溶解度和分散性，可通过制备微乳液、环糊精络合以及脂质体包封等方法改善。而微乳液具有制备工艺简单、热力学稳定以及增溶性好等一系列优点，且在药物传导体系已经运用非常成熟，具有较好的应用前景[10-12]。近年来微乳化技术被广泛应用于常见植物油、色素以及精油等[13-17]的运载和包埋，不仅可以改善其水溶性[18]，还能大幅度提升储藏稳定性[19]。制备微乳区域越大，意味着在一定范围内被大量稀释后，其液滴形态和稳定性可基本保持不变，即稳定性越好[20-21]。本文以澳洲坚果油为油相，借助少量的外部能量如搅拌，以微乳区面积为指标，采用单因素试验设计、Box-Behnken试验设计成功构建并优选出可无限稀释、澄清透明、稳定性好的O/W型微乳液，为将来进一步扩大澳洲坚果油在食品、化妆品等领域的应用范围提供技术依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料及試剂  澳洲坚果油：国家重要热带作物工程技术研究中心澳洲坚果研发部提供，冷榨制取。

吐温80（Tween80，TW-80）、吐温60（Tween60，TW-60）、吐温20（Tween20，TW-20）、司盘80（Span80，SP-80）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（PEG-40）、甘油、1，2-丙二醇，均为食品级，山东优索化工科技有限公司;聚乙二醇400（PEG 400），医药级，山东优索化工科技有限公司;聚蓖麻酸甘油酯（PGPR），食品级，德国Merck公司;无水乙醇、正丁醇、亚甲基蓝、苏丹红Ⅲ，国产分析纯，国药试剂有限公司。

1.1.2  仪器与设备  Nano-ZS90粒径分析仪，英国Malvern仪器有限公司;ETS-D5加热型磁力搅拌器，德国IKA公司;LVEM5台式透射电子显微镜，Quantum量子科学仪器贸易（北京）有限公司;FV10i激光共聚焦显微镜，奥林巴斯（中国）有限公司;ME-104精密型电子天平，Mettler Toledo中国有限公司。

1.2  方法

1.2.1  澳洲坚果油微乳的制备  采用转相乳化法制备澳洲坚果油微乳。将澳洲坚果油与助表面活性剂混合作为混合油相，分别按不同质量比（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9）与表面活性剂混合均匀，在磁力搅拌的条件下逐滴加入去离子水，记录体系由澄清透明变浑浊，再由浑浊变澄清透明时转变点的临界加水量，计算各组分（混合油相、表面活性剂、去离子水）的质量分数。然后分别以混合油相、表面活性剂、水相为3个顶点，根据各组分质量分数确定临界点在相图中的位置，将各点连接起来，绘制伪三元相图，计算微乳区面积[15-16]。

1.2.2  微乳类型鉴定及形态观察  微乳类型用染色法鉴定[22];形态观察分别在激光共聚焦显微镜及透射电子显微镜下进行[11， 23]。

1.2.3  微乳配方的初步筛选  （1）助表面活性剂的确定。将无水乙醇、1， 2-丙二醇、PEG400、甘油和正丁醇作为助表面活性剂，与澳洲坚果油按照3∶1配比作为混合油相，然后与表面活性剂TW-60/PEG-40（3∶1）混合均匀，按照1.2.1方法制备微乳。通过绘制伪三元相图，比较各自形成的微乳区面积大小，确定最佳助表面活性剂种类。

（2）单一表面活性剂的初步选择。在前期预试验的基础上，筛选PEG400：澳洲坚果油=3∶1为较佳的混合油相比例，分别以TW-80、TW-60、TW-20、SP-80、PEG-40、PGPR作为表面活性剂，按照1.2.1方法制备微乳。通过肉眼观察，以外观均一透明，流动性好为作为微乳形成的标准[19]，按照1.2.1方法制备微乳，1.2.2方法对微乳进行鉴定，初步筛选表面活性剂。

（3）复合表面活性剂的筛选。将上述初步筛选得到的表面活性剂TW-60和PEG-40，分别按照质量比5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5与SP-80复配，固定PEG400/澳洲坚果油（3∶1）为混合油相，按照1.2.1方法制备微乳，比较成乳状况和最小可稀释比（The minimum dilution ratio， DR），DR值为微乳拟三元相图中可稀释线所对应的混合表面活性剂与坚果油的最小质量比。

1.2.4  单因素试验  按照1.2.1中的方法制备微乳，分别考察TW-60与PEG-40质量比、PEG400与坚果油质量比和制备温度对澳洲坚果油微乳的微乳区面积大小的影响。

1.2.5  响应面实验设计优化微乳配方  在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件，按照Box-Behnken中心组合實验设计原理设计响应面试验，对澳洲坚果油微乳配方进一步优化。选择TW-60与PEG-40质量比（A）、PEG400与坚果油质量比（B）、制备温度（C）三个因素为考察因素，以微乳区面积SME为响应值，确定最佳试验条件。因素水平如表1所示。

1.2.6  微乳粒径及多分散指数（Polydispersity index， PDI）的测定  采用粒径分析仪测定坚果油微乳的粒径大小和PDI值[18]。平行测定3次，结果取平均值。

1.3  数据处理

所有试验重复3次，使用Microsoft Excel软件、Design-Expert 8.0.6软件和Origin 8.0软件对数据进行绘图和统计分析，AutoCAD 2010软件用于计算微乳区面积。

2  结果与分析

2.1  微乳配方初选结果

2.1.1  助表面活性剂的确定  在微乳伪三元相图中，微乳区面积（SME）大小与载油量、成乳能力以及稳定性均密切相关。助表面活性剂通过渗透到表面活性剂分子之间的空隙，从而形成一个无序的混合膜，以此增加微乳界面柔韧性，减少其形成时所需的界面弯曲能，从而形成微乳。一般选择短链醇作为助表面活性剂，且醇的链长对微乳的粒径，分散性和稳定性有着较大的影响[17， 19]。由图1可知，当以PEG400为助表面活性剂时，形成的SME最大，显著大于以无水乙醇、1， 2-丙二醇、甘油、正丁醇作为助表面活性剂时的SME（p<0.05），所以选择PEG400为最佳助表面活性剂。

2.1.2  表面活性剂初选结果  微乳制备过程中不同表面活性剂，对微乳的性质及形成能力均有较大影响。DR反映了制备坚果油微乳时表面活性剂的最少用量，因此，以DR为指标，初步筛选最佳的坚果油微乳体系的表面活性剂，结果见表2。对于Tween系列表面活性剂，随着疏水链的长度变短，HLB值增大，越不利于微乳的形成，这与梁蓉等[21]的研究结果一致。表面活性剂的HLB值决定微乳的类型，HLB在3～8的表面活性剂可制备W/O型微乳，HLB在8～18的表面活性剂可制备O/W型微乳[24]。考虑到单一的表面活性剂不能很好的形成微乳或形成的微乳不稳定，因此在单一乳化剂初选结果的基础上，通过考察成乳效果和DR值。试验结果表明，选取TW-60和PEG-40作为复合表面活性剂较为合适。

2.2  单因素试验结果

2.2.1  表面活性剂配比的影响  将TW-60/PEG- 40分别按质量比5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5混合作为混合表面活性剂，按照1.2方法制备微乳，绘制出拟三元相图，计算SME，得到的结果如图2所示。由图2可知，TW-60与PEG-40在质量比3∶1条件下成乳区域最大，SME显著高于其他配比，这可能是因为该配比与澳洲坚果油乳化所需的HLB值最接近。所以响应面试验中选择TW-60/PEG-40质量比3∶1为中心点进行优化。

2.2.2  助表面活性剂含量的影响  将PEG400/坚果油分别按质量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1及5∶1混合为混合油相，按照1.2.1方法制备微乳，绘制出伪三元相图，计算SME。由图3可知，随着PEG400含量的增加，SME明显增大，当PEG400与坚果油质量比为3∶1时，SME达到最大，这是因为随着助表面活性剂含量的增加，降低了形成微乳所需的表面活性剂含量[16];继续增加助表面活性剂，SME反而减小，这可能与形成的微乳体系内部结构有关。在最佳条件下，助表面活性剂正好完全镶嵌到表面活性剂中，此时形成的微乳结构中增溶空间最大，载油量最大。但是当助表面活性剂增加至过量时，可与表面活性剂的极性端缔合使混合膜变得松散，微乳区面积反而减小，而且会导致混合膜强度降低，影响微乳稳定性[19-20]。因此，综合考虑响应面试验中PEG400/坚果油质量比为3∶1为中心点进行优化较为合适。

2.2.3  制备温度的影响  制备温度对微乳区面积的影响如图4所示。图4反映了在不同温度条件下所制备微乳的SME的变化趋势。当温度为90 ℃时SME最大，与60 ℃条件下所形成SME差异不显著，温度升高对于提升微乳区的面积并不十分明显，但随着温度的进一步升高，由于澳洲坚果油富含不饱和脂肪酸，可能导致微乳中的澳洲坚果油加速氧化，引起变质。因此，综合考虑选择微乳的制备温度60 ℃为中心点进行优化较为合适。

2.3  响应面试验及结果分析

2.3.1  响应面法确定坚果油微乳较佳配方  将TW-60与PEG-40质量比A（n）、PEG400与坚果油质量比B（k）和制备温度C（t）经过如下变换：A=（n-3）/2，B=（k-3）/1，C=（t-60）/15后作为自变量，以试验中绘制伪三元相图所计算得到的微乳区面积SME（%）为响应值，响应面分析实验方案及结果见表3，回归方程方差分析结果见表4。采用Design-Expert 8.0.6软件，对表3中的实验数据进行多元回归拟合，得出以微乳区面积SME（%）为目标函数的二次回归方程：

表4回归统计分析结果表明：选取的三个因素对SME的影响顺序为：PEG400与坚果油质量比（B）>制备温度（C）>TW-60与PEG-40质量比（A）。模型的F=13.23，p=0.0013<0.01，表明实验的二次模型是极显著的，具有统计学意义。失拟项p值=0.0598>0.05，说明模型不失拟，回归决定系数R2=0.9445，校正决定系数R2Adj=0.8731，说明该二次多项模型可以解释87.31%的响应值的变化，模型能够充分拟合实验数据。因此，可以利用该回归方程对SME的变化进行分析。模型中二次项A2、B2对SME的影响极显著（p<0.01），二次项C2对SME的影响为显著（p<0.05）;一次项B对SME的影响极显著（p<0.01），一次项A、C和交互项AB、AC、BC对SME的影响均不显著（p>0.05），無统计学意义。

明该因素对SME的影响越大，相应表现为SME数值变化的大小。由等高线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。从图5能够看出影响SME最大的因素是B，达到极显著水平，其次是C和A，表4回归分析结果也与此相吻合。

2.3.2  验证试验  通过Design Expert软件分析确定的微乳液最佳制备工艺为TW-60与PEG-40质量比2.51、PEG400与坚果油质量比3.62、制备温度63.8 ℃，此条件下SME的理论预测值为14.13%。考虑到实际操作可行性，将工艺条件调整为TW-60与PEG-40质量比2.5、PEG400与坚果油质量比3.5、制备温度60 ℃，按1.2.1的方法绘制伪三元相图如图6所示。试验得到SME为（13.61±0.42）%，模型预测值为13.74%，与理论预测值相差不大，说明模型可靠，拟合度好，可用于澳洲坚果油微乳液制备工艺参数优化和回归分析。优化得到的微乳液SME数值与梁蓉等[21]制备的丁香油微乳相当。

2.4  微乳类型鉴定结果

如图7所示，在微乳液表面滴加等量染液后观察，蓝色亚甲基蓝在微乳中的扩散速度明显快于红色苏丹红Ⅲ的扩散速度，颜色逐渐扩散到微乳液中表明所制备的澳洲坚果油微乳为水包油（O/W）型。图8为不同配方微乳样品，从2个配方样品外观可以看出澳洲坚果油微乳液基本为澄清透明的液体。

采用上述试验方法制备的微乳剂进行形态观察，激光共聚焦显微镜观察的形态见图9所示，由图可知澳洲坚果油微乳成球形，粒径较小，分布均一;通过透射电镜观察观察微乳形态见图10所示，由图可知澳洲坚果油微乳形态规整，电镜左滴加亚甲基蓝，右滴加苏丹红Ⅲ。

2.5  坚果油微乳的粒径分布及稀释、贮藏稳定性

为探究澳洲坚果油经微乳包埋后的稳定性情况，分别选择图6中O/W型微乳中心区域位置的两条无限稀释线上靠近中心的两个配方点：样品一：混合表面活性剂（TW-60∶PEG-40=2.5∶1）：混合油（PEG400：坚果油=3.5∶1）：水=12∶3∶35（质量比）;样品二为：混合表面活性剂（TW-60∶PEG-40=2.5∶1）：混合油（PEG400∶坚果油=3.5∶1）：水=21∶9∶56（质量比），如图8所示，通过粒径测定，评估其稳定性。

粒径大小和分布是微乳性质最主要的评价指标，澳洲坚果油微乳的粒径分布见图11，澳洲坚果油微乳的粒径分布较为理想，平均粒径为15.23 nm。由表5可知，澳洲坚果油微乳在经过10倍、100倍水相稀释后，微乳粒径变化不大，这表明微乳在稀释过程中粒径能基本保持恒定，而且微乳稀释前后的多分散指数PDI（Polydispersity index）值均较小，说明2种配方制备的微乳稀释稳定性较好。PDI可反应坚果油微乳中粒子的分散宽度，通过粒径分析仪测定（通过仪器自带软件按照国际化标准ISO 13321计算得到）。PDI值在0.1～0.3之间则表示样品是单分散体系，PDI值越大，体系越复杂，表5中测定的PDI值表明澳洲坚果油微乳是单分散体系。储藏稳定性也是影响微乳应用的重要因素，试验通过测定乳液粒径随时间的变化情况来表征。由表5可知。在储藏60 d内，澳洲坚果微乳粒径变化不大，无明显差异，PDI值在储藏过程中也无明显变化，表明2种微乳均能保持良好的贮藏稳定性。

3  讨论

本研究采用转相乳化法制备微乳液，通过绘制伪三元相图，以及单因素试验和Box-Behnken试验成功构建澳洲坚果油O/W微乳体系，并确定了微乳较佳配方：TW-60与PEG-40质量比2.5、PEG400与坚果油质量比3.5、制备温度60 ℃，此条件下形成微乳液的微乳区面积可达13.61%，在DR值为6∶4条件下，澳洲坚果油最大载量占比达到25.0%，并可加水无限稀释。作为一种经济价值较高的油脂，该比例已经足够对其进一步开发应用。通过考察微乳区中心区域的两个配方样品在长期储存、大量稀释过程中粒径大小的变化情况，结果表明两种微乳粒径变化不大，表明其稳定性良好。另外，储藏试验表明粒径较大的澳洲坚果油微乳至少可贮藏100 d，稀释前后的多分散指数PDI值均较小，也说明制备的澳洲坚果油微乳液性质稳定。

澳洲坚果油的生物活性功能被越来越多的研究结果所证实，作为一种保健价值较高的功能性植物油脂，市面上关于澳洲坚果油的加工产品以及以往的科学研究仅限于制作坚果油微胶囊、粉末油脂等方面，虽克服了澳洲坚果油易被氧化的不足，但产品为固体状态，且工业化生产复杂，大大限制了在食品中的进一步应用。本研究提供了一种切实可行的方案，将澳洲坚果油制备成澄清透明、水包油型的食品级微乳液，不但克了服其易氧化和疏水特性，且研究结果表明该微乳液稳定性良好，表现出热力学稳定、粒径小、增容性强等优点。另外，整个工艺过程较为简单，不需特殊设备即可大批量生产，在功能食品以及化妆品领域应用前景良好。

参考文献

杨申明， 范树国， 文美琼， 等. 微波辅助提取澳洲坚果壳多糖的工艺优化及抗氧化性评价[J]. 食品科学， 2016， 37（10）： 17-22.

涂行浩， 张秀梅， 刘玉革， 等. 澳洲坚果壳色素的理化性质及稳定性研究[J]. 食品科学， 2015， 36（15）： 35-39.

刘秋月. 澳洲坚果抗氧化活性成分的研究[D]. 广州： 暨南大学， 2016.

Marisam W. Functional lipid characteristics， oxidative stability， and antioxidant activity of macadamia nut （Macadamia integrifolia） cultivars[J]. Food Chemistry， 2010， 121（4）： 1103-1108.

许  良， 叶丽君， 邱瑞霞， 等. 亚临界丁烷萃取澳洲坚果油的工艺及品质研究[J]. 中国粮油学报， 2015， （6）： 79-83.

Aquino-Bola?os E N， Mapel-Velazco L， Martín-del-Campo S T， et al. Fatty acids profile of oil from nine varieties of Macadamia nut[J]. International Journal of Food Properties， 2017， 20（6）： 1262-1269.

Navarro S L B， Rodrigues C E C. Macadamia oil extraction methods and uses for the defatted meal byproduct[J]. Trends in Food Science & Technology， 2016， 54： 148-154.

張  翔， 刘锦宜， 黄雪松. 坚果的主要生物活性成分及其保健作用[J]. 食品安全质量检测学报， 2017， 8（7）： 2606-2614.

叶丽君， 许  良， 邱瑞霞， 等. 澳洲坚果仁油的品质特性及其氧化稳定性的研究[J]. 中国粮油学报， 2015， 30（7）： 42-47.

Karadag A， Yang X， Ozcelik B， et al. Optimization of preparation conditions for quercetin nanoemulsions using response surface methodology[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2013， 61（9）： 2130-2139.

Bergonzi M C， Hamdouch R， Mazzacuva F， et al. Optimization， characterization and invitro evaluation of curcumin microemulsions[J]. LWT-Food Science and Technology， 2014， 59（1）： 148-155.

Silva J D F， Silva Y P， Piatnicki C， et al. Microemulsions： components， characteristics， potentialities in food chemistry and other applications[J]. Química Nova， 2015， 84（1）： 238-239.

容  欧， 吴雪辉， 龙  婷， 等. 油茶籽油微乳的制备及其性质研究[J]. 中国油脂， 2017， 42（3）： 7-11.

Lourith N， Kanlayavattanakul M， Ruktanonchai U. Formulation and stability of Moringa oleifera oil microemulsion[J]. Soft Materials， 2016， 14（2）： 64-71.

孙长豹， 吴红艳， 贾秀峰， 等. 影响葵花籽油微乳形成的因素[J]. 食品与发酵工业， 2015， 41（9）： 131-134.

满妍妍， 张丽君， 徐怀德， 等. 核桃油微乳制备及水、油渗滤阈值研究[J]. 中国粮油学报， 2015， 30（4）： 80-85.

Ravanfar R， Tamaddon A M， Niakousari M， et al. Preservation of anthocyanins in solid lipid nanoparticles： Optimization of a microemulsion dilution method using the Placket-Burman and Box-Behnken designs[J]. Food Chemistry， 2016， 199： 573-580.

张赟彬， 李维迪， 王一非， 等. 肉桂精油复合微乳体系构建及其在酱牛肉加工中的应用[J]. 现代食品科技， 2016， 32（8）： 156-162.

Shaaban H A， Sadek Z， Edris A E， et al. Analysis and antibacterial activity of Nigella sativa essential oil formulated in microemulsion system[J]. Journal of Oleo Science， 2015， 64（2）： 223-232.

Zheng H M， Li H B， Wang D W， et al. Preparation methods for monodispersed garlic oil microspheres in water using the microemulsion technique and their potential as antimicrobials[J]. Journal of Food Science， 2013， 78（8）： 1301-1306.

梁  蓉， 钟  芳， 王  浩， 等. 丁香油微乳的制备及抑菌活性研究[J]. 食品与机械， 2016， 32（7）： 127-131.

鲁梦齐， 向  东. 椰子油微乳的制备及其性质研究[J]. 食品与发酵工业， 2017， 43（4）： 171-176.

Chen J， Ma X， Yao G， et al. Microemulsion-based anthocyanin systems： effect of surfactants， cosurfactants， and its stability[J]. International Journal of Food Properties， 2018， 21（1）： 1152-1165.

Kumar R， Kumar S， Sinha V R. Evaluation and optimization of water-in-oil microemulsion using ternary phase diagram and central composite design[J]. Journal of Dispersion Science & Technology， 2016， 37（2）： 166-172.

吴红艳， 孙长豹， 刘  宁， 等. 月见草油微乳体系的微观结构研究[J]. 东北农业大学学报， 2014， 45（5）： 44-51.