顶空固相微萃取-气质联用分析香荚兰浸膏风味组分的条件优化

2019-06-11徐飞李俄艳初众张彦军

热带作物学报 2019年2期

徐飞李俄艳初众张彦军

摘要为选择适宜的香荚兰浸膏萃取条件，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术，以固相微萃取样品处理量、萃取温度和萃取时间三个条件分析各萃取条件对香荚兰浸膏风味组分、面积及含量的影响。结果表明：在实验范围内香荚兰浸膏最佳萃取条件为萃取样品添加量2.0 g、萃取温度80 ℃、萃取时间25 min。最佳条件下香荚兰浸膏鉴定出匹配度90以上的化合物45种，此条件下总化合物面积（×1011）及香兰素面积（×1010）最高分别为1.04±0.09、6.99±0.46，匹配度90以上化合物占总化合物相对百分含量的90.24%;香荚兰中主要化合物醛类百分含量占总化合物相对百分含量的72.03%。

关键词顶空固相微萃取;气相色谱-质谱;香荚兰浸膏;风味组分

中图分类号 TQ654.2 文献标识码 A

香荚兰（Vanilla planifolia Andrews），又名香草兰、香子兰，典型的热带多年生攀缘藤本植物，素有“食品香料之王”的美誉[1]，是世界上使用最广泛的调香原料之一[2]，其发酵后的豆荚形成的独特香味是人工合成香料无法比拟的[3]。香荚兰豆荚可直接使用，但其芳香成分无法较好的释放到其他产品中[4]，所以经常利用的是香荚兰浸膏、酊剂等提取物。香荚兰浸膏是经有机溶剂浸提后，再次浓缩所得产物，既保留香荚兰独有风味又不含有植物组织。因此，工业上一般采用溶剂浸提制备香荚兰浸膏，将其应用在高级食品、医药、化妆品、保健品等产品中[5]。

目前，浸膏提取主要采用水蒸气[6-7]、溶剂提取[8-9]、超临界萃取[10]、微波萃取[11]、超声提取[12]等。国内外对浸膏研究较多，主要集中在浸膏提取工艺优化、浸膏挥发性成分分析、浸膏功能特性研究等方面。张玲等[13]以无水乙醇为浸提剂，采用Box-Behnken响应面优化浸提工艺，提取菠萝蜜芳香浸膏并进行风味分析。孙铭忆等[14]选取化学指标结合药效学指标，通过模糊层次分析法赋权，优选出复方黄芪水浸膏的提取工艺路线。徐飞等[5]采用有机溶剂法对香荚兰浸膏进行精制，通过电子鼻、感官评定确定最佳溶剂，以主要化合物含量优化溶剂比例及萃取次数，利用气相色谱-质谱法检测浸膏精制前后挥发性成分相对含量。关体青等[15]采用在线裂解-气相色谱-质谱（Py-GC- MS）联用技术对天然香料秘鲁浸膏的热裂解行为及产物进行研究，分别在300、600、900 ℃对秘鲁浸膏进行热裂解，并对裂解产物进行定量和定性分析。但目前关于顶空固相微萃取-气质联用分析香荚兰浸膏风味组分的研究鲜见报道。

香荚兰浸膏是香荚兰豆荚经过无水乙醇提取后浓缩产物，保留了香荚兰豆荚的主要风味组分，但其风味组分及含量是否受到固相微萃取条件的影响仍尚未明确。为了明确香荚兰浸膏中的主要风味组分及含量，本研究以无水乙醇常温浸提后减压浓缩制备的香荚兰浸膏为原料，采用顶空固相微萃取-气质联用技术分析不同的萃取条件对香荚兰浸膏的风味组分及含量的影响，明确香荚兰浸膏风味组分及相对含量。

1 材料与方法

1.1 材料

香荚兰浸膏，中国热带农业科学院香料饮料研究所自制。C7～C30 正构烷烃标准品，上海安谱实验科技股份有限公司。

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，上海安谱实验科技股份有限公司;电子分析天平，美国Ohaus公司;7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司;手动固相微萃取装置，美国Supeleo公司。

1.2 方法

1.2.1 香荚兰浸膏的制备准确称取450 g香荚兰粉末（过20目筛）于多功能真空浓缩机中，加入10 L体积分数80%的乙醇溶液室温[（26±1） ℃]浸提40 d，减压回收乙醇至乙醇不再蒸出为止，即得香荚兰浸膏。

1.2.2 香莢兰浸膏处理条件以香荚兰浸膏中香兰素及总化合物面积为优化条件，分别称取不同质量的香荚兰浸膏（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g）于15 mL固相微萃取瓶中，50 ℃平衡20 min，DVB/CAR/PDMS萃取头振荡萃取20 min后于250 ℃进样口解析附。优化得到香荚兰浸膏添加量后分别进行温度、时间条件处理，温度梯度为（40、50、60、70、80 ℃）、时间梯度为（10、15、20、25、30 min），每组样品3个平行。

1.2.3 香荚兰浸膏风味组分分析色谱条件为：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm）;进样口温度250 ℃，初始温度40 ℃，以3 ℃/min的速率升温至90 ℃，再以1.5 ℃/min的速率升温至140 ℃，最后以4 ℃/min的速率升温至220 ℃并保持0 min，最终温度为250 ℃，后运行时间2 min;载气为氦气，流速1 mL/min，不分流进样。

质谱条件：电离方式EI; 电子能量70 eV;离子源温度250 ℃;传输线温度280 ℃;连接口温度250 ℃;电子倍增电压1200 V;扫描方式：全扫描;质量扫描范围m/z 30～300。

1.3 数据处理

固相微萃取的样品处理量、萃取温度、萃取时间下风味组分及相对含量数据处理通过NIST 14谱库结合保留指数定性，选择与谱库中化合物相似度高于90（最大值100）的组分鉴定结果，结果以峰面积百分比表示风味组分的相对含量。数据采用平均值±标准差表示，使用SPSS 19.0软件进行数据标准差统计分析。

2 结果与分析

2.1 固相微萃取的样品处理量对香荚兰浸膏风味组分的影响

固相微萃取香荚兰浸膏样品各处理条件（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g）下的风味组分见表1。匹配度90以上的化合物共鉴定出37种，固相微萃取样品不同处理量条件下鉴定出香荚兰浸膏风味组分含量分别为78.23%、77.02%、77.53%、77.02%、80.53%。香荚兰浸膏中含有醛类化合物4种，种类不多，但百分含量较高，各处理量条件下醛类化合物峰面积百分比均为51.26%以上;酯类化合物25种，种类较多，占化合物种类的68%以上，其峰面积占总化合物峰面积的11.43%～18.81%;此结果与董智哲等[16]固相微萃取分析香荚兰中的挥发性成分具有较大区别，董智哲等的研究表明香荚兰豆荚中醛类化合物种类16种，酯类2种，而本研究的浸膏中匹配度90以上的醛类有4种，酯类达到25种，对应的百分含量也有增加。这可能是由于萃取头及样品形态不同，以致结果存在一定差异。酯类是芳香物质的主要载体，酯类物质种类的增多也进一步说明了提取后的香荚兰浸膏香味更为浓郁、独特。醇类化合物4种，醇类化合物占总化合物百分含量1.41%～1.64%;酚类化合物3种，酚类化合物占总化合物百分含量5.49%～6.80%;醚类化合物1种，醚类化合物占总化合物百分含量0.39%～ 0.47%。从固相微萃取的样品处理量对香荚兰浸膏风味组分分析得到，匹配度90以上化合物百分含量占到77.02%以上，有效地反应了香荚兰浸膏中主要的风味物质组成。香荚兰浸膏中醛类化合物种类不多，但百分含量较高，占据了总化合物百分含量的51.26%以上，与董智哲等[16]文献中醛类化合物占总化合物百分含量结果一致。而酯类化合物种类较多，是香荚兰浸膏中的主要化合物种类，酚类与醇类化合物百分含量不高，但对浸膏中香味也具有一定的贡献。

由表1可知，鉴定出匹配度90以上的香荚兰浸膏风味种类随萃取量的增加而增加（分别为27、29、29、31、31种）。表1显示固相微萃取样品不同处理量条件下香兰素的相对含量均占总含量的42.79%以上，可见香兰素是香荚兰浸膏中的主要风味组分。固相微萃取样品不同处理量条件下化合物总面积、香兰素总面积（×1010）最大分别为3.21±0.08、1.49±0.05，此时香荚兰浸膏添加量为2.0 g。香兰素百分含量表示香蘭素占所有化合物的百分比，而面积的大小表示化合物含量的多少，因此以香兰素总面积及化合物总面积为标准优化最佳萃取添加量。综上分析，香荚兰浸膏添加量为2.0 g时萃取得到化合物最多，总面积最高，香兰素含量最高。在实验范围内香荚兰浸膏添加量为2.0 g时萃取效果最好。

2.2 固相微萃取温度对香荚兰浸膏风味组分的影响

在固相微萃取香荚兰浸膏样品处理量为2.0 g，萃取时间为20 min，固相微萃取不同温度条件下（40、50、60、70、80 ℃）的香荚兰浸膏风味组分见表2。共鉴定出匹配度90以上的化合物60种，固相微萃取不同温度条件下鉴定出的香荚兰浸膏风味组分含量分别为74.24%、80.25%、80.68%、86.08%、89.65%。不同温度处理条件下香荚兰浸膏风味组分分析可见匹配度90以上化合物百分含量占74.24%以上，能有效地反应出香荚兰浸膏中的主要风味组分。香荚兰浸膏中含有醛类5种，固相微萃取不同处理温度下醛类化合物峰面积占总化合物的45.50%～73.39%;酯类化合物40种，种类最多，占匹配度90以上化合物种类的67%，酯类化合物占总化合物百分含量10.75%～21.18%;醇类化合物4种，占总化合物百分含量0.49%～1.41%;酚类化合物4种，酚类化合物占总化合物百分含量2.21%～7.07%;醚类化合物1种，醚类化合物占总化合物百分含量0～0.85%;酸类化合物2种，酸类化合物占总化合物百分含量0～0.19%;酮类化合物1种，酮类化合物占总化合物百分含量0～0.09%;烯烃化合物1种，烯烃类化合物占总化合物百分含量0～0.03%;烷烃化合物2种，烷烃类化合物占总化合物百分含量0～0.06%。香荚兰浸膏中醛类化合物占总化合物百分含量的45.50%以上。酯类化合物种类较多，其他化合物百分含量不高，但均参与了香荚兰浸膏中香味贡献。

由表2可见，固相微萃取温度对香荚兰浸膏风味组分分析得到，萃取不同温度处理条件下种类逐渐增加分别为（25、32、39、44、49种），说明温度对香荚兰浸膏风味组分的影响比萃取样品处理量的影响更为显著。萃取温度在60、70、80 ℃时，香兰素的相对含量逐步增加，80 ℃香荚兰浸膏相对百分含量最高为68.95%。此研究结果与董智哲[17]研究香荚兰萃取温度条件结果一致，但化合物差别较大，香荚兰中芳香族化合物较多，而浸膏中酯类及醛类化合物较多。萃取不同温度处理条件下总化合物面积、香兰素面积（×1010）最高分别为9.24±0.48、6.38±0.46，此时萃取温度为80 ℃。综上所述，固相微萃取温度为80 ℃时总化合物面积、香兰素面积、百分含量及化合物种类均最高。因此，筛选得到最优萃取温度为80 ℃。

2.3 固相微萃取时间对香荚兰浸膏风味组分含量的影响

在固相微萃取香荚兰样品处理量为2.0 g，萃取温度为80 ℃条件下，萃取不同时间处理条件（10、15、20、25、30 min）的香荚兰浸膏风味组分见表3。共鉴定出匹配度90以上的化合物62种，固相微萃取不同时间处理条件下鉴定出的香荚兰浸膏风味组分含量分别为88.68%、87.17%、89.68%、90.24%、90.81%。萃取不同时间条件下香荚兰浸膏风味组分分析可见匹配度90以上化合物百分含量占86.68%以上，说明萃取时间对香荚兰浸膏的风味组分含量影响较大。

固相微萃取不同时间处理条件下香荚兰浸膏中含有醛类6种，醛类化合物分别占总化合物含量为71.22%～73.39%;酯类化合物35种，种类较多，占匹配度90以上的化合物种类的56%;此研究结果与谷风林[18]研究的香荚兰风味组分具有较大区别，香荚兰中芳香族化合物较多，酯类化合物较少，而浸膏中酯类化合物最多，这可能是由于香荚兰提取过程中醇跟羧酸或含氧无机酸生成酯，酯类物质具有浓郁的果香，这与浸膏中香味比原豆荚浓郁具有较大关系。酯类化合物占总化合物含量12.23%～14.43%;醇类化合物5种，醇类化合物占总化合物含量0.47%～ 0.94%;酚类化合物4种，酚类化合物占总化合物含量1.95%～ 2.28%;醚类化合物1种，占总化合物含量0～ 0.79%;酸类化合物6种，酸类化合物占总化合物含量0.10%～0.38%;酮类化合物1种，酮类化合物占总化合物含量0.08%～0.13%;烯烃类化合物1种，烯烃类化合物占总化合物化合物含量0.03%;烷烃类化合物3种，烷烃类化合物占总化合物含量0～0.06%;香荚兰浸膏中醛类化合物占总化合物含量的71.22%以上。

以上结果说明固相微萃取样品处理量、萃取温度，萃取时间对香荚兰浸膏的风味组分具有一定的影响，且香荚兰浸膏中的主要化合物醛类达到了71.22%以上。说明此条件下已萃取出香荚兰浸膏中的大部分主要风味物质。

由表3可见，随着固相微萃取时间的增加化合物种类先增加后减少（分别为45、48、49、45、45种），固相微萃取不同时间条件下总化合物面积（×1011）、香兰素面积（×1010）最高分别为1.04±0.09、6.99±0.46，此条件下萃取时间为25 min。虽然萃取浸膏20 min时化合物种类最多，但香荚兰浸膏中主要化合物为香兰素，其占总化合物含量为67%～69%，因此香兰素的面积大小能直接反映香兰素含量的多少，以香荚兰浸膏中化合物总面积及香兰素面积为判断标准，香兰素及总化合物面积均显示25 min时面积最大，含量最多。综上所述，在实验范围内筛选优化得到萃取时间在25 min为固相微萃取香荚兰最佳萃取时间。

3 讨论

通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术分析不同萃取条件下香荚兰浸膏的风味组分及含量的影响。结果表明，固相微萃取时间、萃取温度、萃取处理量均对香荚兰浸膏的风味组分及含量具有一定的影响，其中优化三者条件下鉴定出的匹配度90以上的化合物种类分别为62、60、37种，含量分别为87.17%～90.81%、74.24%～ 89.65%、77.02%～80.53%;醛类化合物含量三者分别为71.22%～73.39%、45.50%～73.39%、51.26%～58.33%;酯类及醛类种类分别为35、6种，40、5种，25、4种;以上分析说明固相微萃取时间对风味物质的组分及含量影响最大，其次是萃取温度和萃取量。以各萃取处理条件下总化合物、香兰素峰面积为优化标准，筛选得到香荚兰浸膏萃取固相微样品处理量为2.0 g，萃取温度80 ℃，萃取时间25 min时，匹配度90以上的化合物种类相对较多（45种），此条件下萃取得到化合物面积（×1011）及香兰素面积（×1010）最高（1.04±0.09、6.99±0.46）、香荚兰中主要化合物醛类百分含量占总化合物相对百分含量的72.03%。综上分析得到萃取香荚兰浸膏的固相微最优条件为样品添加量2.0 g、萃取温度80 ℃、萃取时间25 min。

参考文献

宋应辉，王庆煌，赵建平，等. 香草兰产业化综合技术研究[J]. 热带农业科学， 2006， 26（6）： 43-46.

Gonzalez-Arnao M T， Lazaro-Vallejo C E， Engelmann F， et al. Multiplication and cryopreservation of vanilla （Vanilla planifolia ‘Andrews）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2009， 45（5）： 574-582.

Menon S， Nayeem N. Vanilla planifolia： A review of a plant commonly used as flavouring agent[J]. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review & Research， 2013， 20（2）： 225-228.

Gu F， Xu F， Tan L， et al. Optimization of enzymatic process for vanillin extraction using response surface methodology[J]. Molecules， 2012， 17（8）： 8753.

徐飛，李娜，初众，等. 香荚兰浸膏精制工艺优化及挥发性成分分析[J]. 食品科学， 2018， 39（4）： 188-193.

程晓雪. 麻杏竺胆颗粒提取工艺的研究[J]. 当代医药论丛， 2018， 16（2）： 154-155.

邵雪庆，唐晓萌，杨盟，等. 愈肠颗粒的提取工艺研究[J]. 药学实践杂志， 2018（1）： 46-49.

陈汝玲，吴江顺，吴静澜，等. 紫金抗病毒中药唇膏的提取[J]. 现代医学与健康研究电子杂志， 2018， 2（1）： 130-131.

师苑，朱红薇，张运洋，等. 桦褐孔菌不同提取物提取工艺及生物活性研究[J]. 广州化工， 2018， 46（7）： 67-69.

郭永来，张静菊，刘泗明. 超临界二氧化碳萃取玫瑰浸膏的研究[J]. 香料香精化妆品， 2018（1）： 17-19.

张静姝，刘春叶，靖会，等. 酸枣仁皂苷的不同提取与纯化工艺对比研究[J]. 应用化工， 2018， 47（1）： 56-58.

李艳萍，李海燕，纪晓婉，等. 金钗石斛叶中总黄酮的提取分离及体外抗阿尔茨海默病活性研究[J]. 中国药房， 2018， 29（3）： 330-333.

张玲，张云飞，李春海，等. 菠萝蜜芳香浸膏提取工艺及挥发性成分分析[J]. 食品研究与开发， 2018， 39（3）： 41-48.

孙铭忆，李冰韶，王永洁，等. 基于模糊层次分析法优选复方黄芪水浸膏提取工艺路线[J]. 中草药， 2018， 49（2）： 325-329.

关体青，张博，张丽，等. 秘鲁浸膏热裂解产物分析研究[J]. 轻工科技， 2018， 34（2）： 5-6.

董智哲，谷风林，徐飞，等. 固相微萃取和同时蒸馏萃取法分析海南香草兰挥发性成分[J]. 食品科学， 2014， 35（2）： 158-163.