木麻黄茎腐病病原菌的鉴定及其生物学特性测定

吴如慧 李增平 陈礼浪

摘  要  通过对海南种植的木麻黄上发生的茎腐病病原菌进行致病性测定、形态学特征鉴定和ITS序列分析，确认引起海南木麻黄茎腐病的病原菌为二孢假芝[Amauroderma subresinosum （Murrill） Corner]。生物学特性测定结果显示，黑暗可以促进菌丝生长，菌丝最适生长温度为32 ℃，最适pH为6.0，蔗糖和大豆蛋白胨为最佳碳源和氮源。

关键词  海南;木麻黄;茎腐病;二孢假芝;生物学特性

中图分类号  S792.93      文献标识码  A

木麻黄（Casuarina equisetifolia Forst.）具有速生、喜炎热气候，耐干旱、贫瘠，抗盐渍等功能，因此是海岸前缘的砂质地带无可替代的防风林树种[1-2]， 而台风是海南岛最主要的自然灾害，因此种植木麻黄对减轻台风带来的灾害和保护人们生命财产安全十分重要。

作为沿海防护林主要树种的木麻黄，在生长过程中易遭病原木腐菌的侵害而发生根腐或茎腐病。特别是常因台风造成断杆、断枝后，更易被病原木腐菌侵染，大量病株整株枯死，造成防护林林相被破坏，削弱其生态功能。因此保持海岸带木麻黄防护林的生态功能，有效防治木麻黄上发生的病原木腐菌危害，进一步提升木麻黄林的经济效益，为生产防控提供理论依据，有必要对海南能侵染木麻黄活立木的病原木腐菌进行研究。

笔者在对海南省的海口、文昌、澄迈、临高、儋州、东方等地的木麻黄林地进行病害调查时，发现假芝属（Amauroderma）的一種木腐菌易侵染木麻黄活立木的茎干引起茎腐病，株发病率为2%～3%，最终导致发病植株整株枯死，而关于此病尚未见有报道。假芝属（Amauroderma）由美国真菌学家William Alphonso Mur rill于1905年建立， 指定模式种为Amauroderma schomburgkii （=Fomes regulicolor）[3]。假芝属真菌主要分布于热带和亚热带地区，在我国华南和西南的部分地区分布较多。我国假芝属的分类学研究始于邓叔群。1980年以来，前人对我国的假芝属作了大量的研究工作，报道了产于我国的二孢假芝（A. subresinosum）、厦门假芝（A. amoiense）、耳匙假芝（A. auriscalpium）、华南假芝（A. austrosinense）等22个种[4-6]。但未见有二孢假芝（A. subresinosum）引起活立木茎腐病的报道。因此，本研究从海南省不同市县的发病木麻黄林地取样，明确其病原菌种类及生物学特性，旨在为进一步研究该病害的发生、流行规律及综合防治提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试样本及接种苗木  于2015年11月从海南省的海口、文昌、澄迈、临高、儋州、东方等地发病的木麻黄根茎部采集新鲜担子果样本分别编号HNCM001～HNCM010，样品均用保鲜袋包装后带回实验室备用。木麻黄苗由海南大学热带农林学院提供。

1.1.2  培养基  马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基和查彼（Czapek）培养基，具体配制方法参阅方中达《植病研究方法》[7]配制，木屑培养基参考高秀兵等[8]方法配制。

1.1.3  试剂及仪器  E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit，OMEGA Extraction Kit，2×Taq-Mixture，DNA Marker。Olympus BX 51 显微镜。

1.2  方法

1.2.1  菌株分离纯化培养  采用常规组织分离法从采集的新鲜担子果上分离菌株，先用70%酒精对担子果表面消毒，再用灭菌的手术刀将担子果边缘表皮削除，用灭菌的镊子夹取带菌管处的菌肉接种到PDA上，28 ℃恒温培养，从分离纯化后获得的相同菌株中选择HNCM004，转入PDA培养基扩繁保存备用[7]。

1.2.2  接种体的制备  从纯化后的菌株菌落上挑取边长约1 cm的正方形菌丝块放置于已灭菌的袋装木屑培养基中制备接种体，放置到28 ℃培养箱进行恒温黑暗培养20 d左右，直至菌丝布满整个培养基。用接入空白琼脂块的木屑培养基作为空白对照。

1.2.3  菌株的致病性测定及担子果诱导  先在待接种植株桉树、木麻黄、橡胶树3种苗木的茎干表面喷70%酒精进行表面消毒，再用灭菌手术刀对待接种植株进行轻微创伤，将布满菌丝的接种体紧紧贴在切口处，并用棉花进行保湿，最后用保鲜膜缠绕固定。每个处理设置3个重复，对照株用同样的方法接空白木屑培养基。接种后每隔10 d对苗木长势和侵染情况进行观察，并进行拍照记录。接种方法参照高秀兵等[8]方法，略作改动。

挑取纯化后的边长1 cm的含菌株HNCM004菌丝体的正方形培养基块放置于已灭菌的瓶装木屑培养基中进行担子果诱导，放置到室内对其进行保湿，定时观察。

1.2.4  病原菌的鉴定  形态鉴定：参考《中国真菌志： 第十八卷 灵芝科》[6]和《中国大型真菌》[10]等资料对样本的子实体进行宏观特征与显微结构的描述与鉴定。并在光学显微镜下对病原菌的显微结构观察、测量并拍照。

分子鉴定：将菌株培养5 d后收集100 mg菌丝体，使用OMEGA Fungal DNA Kit来提取DNA。以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′）[10]扩增rDNA基因内部转录间隔区序列，引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。扩增产物在恒压 150 V下用1%琼脂糖凝胶电泳检测。使用OMEGA Extraction Kit试剂盒对产物进行切胶回收目的片段，纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果在 NCBI 上进行 BLAST 比对分析，并提交序列。利用MEGA 6.0软件以邻接法（neighbor- joining，NJ）构建系统发育树[11]。

1.2.5  生物学特性测定  菌株培养4 d后用直径5 mm 的打孔器对其菌落边缘打取菌饼，并将菌饼接种各供试培养基进行培养，4 d后十字交叉法测量菌落直径。各培养基设置3个重复。除碳、氮源生物学测定外，其他条件所使用的培养基均为PDA培养基。

（1）温度：将菌饼接种PDA培养基后置于15、20、25、28、30、32、34、36、38、40 ℃共10个不同温度条件下恒温黑暗培养。

（2）光照：测定条件设置为完全黑暗、日光灯连续照射、12 h光暗交替3种条件，28 ℃恒温培养。

（3）pH：在已灭菌的PDA培养基凝固之前，用 1 mol/L 的HCl 和 1 mol/L 的 NaOH 将pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9共8个梯度，28 ℃恒温培养。

（4）碳、氮源：将不加蔗糖、硝酸钠的Czapek培养基作为基础培养基，分别称取等质量的葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、甘露醇、D-木糖、D-果糖、D-半乳糖、蔗糖、α-乳糖、肌醇、D-山梨醇、甘油作为碳源;酵母浸膏、牛肉膏、大豆蛋白胨、L-天冬酰胺、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钙、草酸铵、硝酸钠、硝酸钾作为氮源，以不添加碳、氮源的Czapek培养基作对照，设3组重复接菌饼进行测定。

1.3  数据处理

利用Excel 2010软件和SAS 9.1软件进行数据统计分析，采用Duncans multiple range test進行差异显著性分析。

2  结果与分析

2.1  病害症状描述

发生茎腐病的木麻黄树冠稀疏，生长不良、枯枝多、无光泽，后期整株枯死，病株易被强风

连根吹倒。在病树的茎干、近地面的茎基部上长出初期呈红褐色、后期呈黑褐色檐状担子果，病树茎干木质部组织白腐（图1）。

2.2  致病性测定

5个月后检查接种菌株HNCM004的木麻黄、桉树和橡胶树茎基部受侵染情况，结果发现接种后的木麻黄等树冠稀疏，生长不良、枯枝多、叶片无光泽，重病株整株枯死（图2A），在木麻黄等茎干接种处发现接种部位已经长满白色菌丝，接种菌已从接种部位侵染入木麻黄茎干木质部并扩展，接种部位周围茎干组织呈褐色，茎干组织呈现白色腐朽（图2B，图2C），与田间发病症状相同，对照组无明显变化（图2D，图2E）。采集发病组织进行分离获得相同的菌株，表明分离菌HNCM004为致病菌。用菌株HNCM004在瓶装木屑培养基上接种一个月后，白色致密菌丝布满整个培养基，5个月后长出与树上相同的担子果（图2F）。

2.3  病原菌的鉴定

2.3.1  形态观察  （1）菌落生长特性：该病原菌在PDA培养基上的菌落呈白色，菌丝中间较浓密边缘稀薄，平伏生长，边缘近圆形（图3A）。菌丝老化后变为乳白色至浅黄色。

（2）担子果：担子果通常一年生，无柄，菌盖近扇形、半圆形或近圆形，大小（8～22） cm×（13～ 29） cm，厚2.3～4.2 cm，单生或多个连生于近地面1～3 m左右的茎干上或茎基部;新生担子果上表面红褐色，长大后上表面变黑褐色，稍有光泽，多数同心环带明显，有显著放射状纵纹，近边缘处红褐色，边缘呈黄白色波浪状;下表面的菌肉浅黄白色或污白色;菌管长0.3～0.9 cm，呈黄色。孔面污白色，管口近圆形，每毫米4～6个。干燥的担子果边缘向下向内弯曲，中央上凸，呈贝壳状，质量变轻（图3B～图3G）。

（3）显微结构：皮壳构造似栅栏状组织，淡黄褐色（图3 H）。菌丝系统三体型：生殖菌丝透明、薄壁，直径为2.9～4.1 μm;骨架菌丝近无色或稍带淡褐色，厚壁到实心，骨架干直径为3.6～5.1 μm，呈树状分支，分支末端形成鞭毛状无色缠绕菌丝;缠绕菌丝厚壁，有分枝，直径1.3～2.6 μm（图3I，图3J）。担孢子有大小两种，大孢子卵圆形或宽椭圆形，双层壁，外壁透明，平滑，内壁无色到淡黄色，有小刺或小刺不清楚，大小为（11.0～13.8）μm×（8.8～10.2）μm，小孢子椭圆形，单壁，无色，（3.9～5.4）μm×（2.1～3.9）μm（图3K）。

2.3.2  rDNA-ITS序列比对和发育树构建  测序后获得HNCM004菌株的rDNA-ITS序列为611 bp，NCBI在线Blastn比对所得ITS序列（NCBI登录号为MH537850）与NCBI登录号为LC176784.1、LC176756.1、FJ154778.1等的二孢假芝菌（Amauroderma subresinosum）序列的相似度最高，达100%。将HNCM004菌株ITS序列与GenBank中已有的ITS基因序列进行同源性比较，利用MEGA 6.0软件构建系统进化树，分析同源关系。结果显示，菌株HNCM004与二孢假芝遗传距离最小，聚为一类，其rDNA-ITS序列与二孢假芝的同源性达100%（图4）。结合形态学特征观察及分子生物学技术鉴定结果，确定HNCM004菌株为二孢假芝菌[Amauroderma subresinosum （Murrill） Corner]。

2.4  生物学特性

2.4.1  温度对二孢假芝菌丝生长的影响  不同温度对菌株菌落生长的影响差异显著。当温度在20～38 ℃之间，二孢假芝菌株HNCM004菌丝均能生长，适宜生长温度为25～34 ℃，最适生长温度为32 ℃，到40 ℃时停止生长（图5）。

2.4.2  光照对二孢假芝菌丝生长的影响  不同光照条件对菌株菌落生长的影响差异显著。在完全黑暗条件下菌株菌落生长速度最快，菌落边缘整齐，菌丝呈透明白色毛絮状，生长均匀，在连续光照条件下生长最慢，菌丝中部呈乳白色，边缘透明稀薄（图6）。

2.4.3  pH对二孢假芝菌丝生长的影响  不同pH条件对菌株HNCM004菌落生长的影响差异显著。菌株HNCM004在pH 3～8之间均可生长，pH 6时菌落直径极显著高于其他处理，表明最适宜生长pH值为6，pH 3～7与pH 8处理间菌落直径差异显著（图7），表明二孢假芝相较于碱性环境，更适合在弱酸性至中性环境中生长。

2.4.4  碳、氮源对二孢假芝菌丝生长的影响  供试的13种碳源培养基均能够显著促进二孢假芝菌株HNCM004菌丝生长，其中在以甘露醇为碳源的菌落直径最大，但其菌丝稀薄近透明，长势较差;其次为蔗糖、葡萄糖、D-木糖和D-半乳不同大写字母表示0.01水平上差异极显著，不同小写字母表示0.05水平上差异显著。

糖上菌落较大且菌丝较厚，长势优良;在α-乳糖和甘油中菌落直径最小，且菌落稀薄。表明不同的碳源或者不同种类的同类型碳源对二孢假芝菌丝生长的影响存在一定的差异（表1）。

供试的 12 种氮源培养基对二孢假芝菌株HNCM004菌丝生长的影响存在一定的差异，单一氮源以氯化铵为氮源的菌落长势最好，草酸铵为氮源的菌落直径最小。在缺氮元素的培养基中，菌丝稀薄。复合氮源中大豆蛋白胨菌落直径最大，菌落圆形，致密（表2）。

3  讨论

本课题组目前已在木麻黄活立木根部或茎干上发现有多种病原木腐菌寄生引起根腐或茎腐病，包括南方灵芝 [Ganoderma austral （Fr.） Pat.]、 褐灵芝[G. brownie （Murrill） Gilb.]、 黎母山灵芝[G. limushanense J.D. Zhao et X.Q. Zhang]、热带灵芝[G. tropicum （Jungh.） Bres.]、 上思灵芝（G. shangsiense J. D. Zhao）、 薄盖灵芝[G. capense （Lloyd） D. A. Reid]、有 害 木 层 孔 菌 [Phellinus noxius （Co rner） Cunningham]，二孢假芝 [A. subresinosum （Murrill） Corner] 也是其中发现的一种重要的病原木腐菌[12]。该菌在海南的三亚、保亭、儋州等地生长的桉树、槟榔和非洲楝上也有发现，初步研究结果显示也是这几种植物的致病菌。

笔者在海南的海口、文昌、澄迈、临高、儋州、东方等地的木麻黄上发现的引起木麻黄茎腐病的假芝属木腐菌，经形态学特征比较并结合分子生物学鉴定分析，确定引起此种茎腐病的病菌为二孢假芝[A. subresinosum （Murrill） Corner]。该病原菌在黑暗条件下易于生长，光照对其生长存在抑制作用;最适pH为6;25～34 ℃为适宜生长的温度范围，最适生长温度为32 ℃;在测定的几种碳源中，以蔗糖为碳源的菌落长势最好;在氮源方面，单一氮源以氯化铵为氮源的菌落长势最好。在复合氮源中，大豆蛋白胨为氮源长势最好。田间调查中发现，发病区的环境湿度和光照强弱，会改变木麻黄病株茎基生长出的二孢假芝担子果的颜色及厚度，湿度高、光照弱，担子果上表面呈红褐色，较厚实;湿度低、光照强，担子果上表面呈黑褐色，较薄。

虽然许多真菌学家都曾从不同角度对假芝属成员进行过研究[13-14]，但总得说来，目前国内外关于假芝属的研究资料集中于分类学特性部分[3-6]。目前尚未见对二孢假芝[A. subresinosum （Murrill） Corner]生物学特性以及致病性等内容的研究。本研究填补了这项空白，也为有效防治木麻黄上发生的病原木腐菌害，进一步提升木麻黄林的经济效益，为生产防控提供理论依据。

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