芒果无机焦磷酸酶基因的克隆及其表达载体构建

白蓓蓓 荆永琳 蔡秉宇 蓝丽 王佳 赵志常

摘  要  无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase，PPase）催化焦磷酸（PPi）水解为2个无机正磷酸（Pi），是蔗糖合成途径中的调控关键节点之一。本研究根据已经报道的PPase基因的序列设计兼并引物，采用3′ RACE和5′ RACE方法，从贵妃芒果的果实中克隆得到了一个芒果PPase基因，将其命名为MiPPase，其全长cDNA序列为1014 bp，开放阅读框为837 bp，编码278个氨基酸，分子量为30.85 ku，等电点为4.68。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与红花烟草具有较近的亲缘关系。为深入探究MiPPase基因在蔗糖代谢过程中的作用，本研究成功构建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因过量表达载体，为后续研究MiPPase基因在芒果果实蔗糖合成的作用机理提供理论依据。

关键词  芒果;PPase;基因克隆;表达载体构建

中图分类号  S667.7; Q78      文献标识码  A

无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase，PPase）是以焦磷酸为底物的水解酶，能够水解多种代谢途径中产生的焦磷酸（PPi），在自然界中广泛存在[1-2]。PPase在植物组织中存在2种类型：一类是可溶性无机磷酸酶（soluble inorganic pyrophos-phatase，sPPase），主要存在于细胞质基质和细胞器中[3-4];第二类是膜结合焦磷酸酶（vacuolar pyrophosphatase，V-PPase），是不可溶性酶，主要与膜相结合。其中与线粒体膜相结合的PPase与可溶性无机磷酸酶结构相似，均含有24个保守氨基酸，而功能却与没有24个保守氨基酸的与液泡膜结合的PPase相近[5-6]。自然界中大部分PPase都是可溶性的，其主要功能就是水解PPi。PPi属于一种高能化合物，水解释放大量能量，可以为生物体代谢过程提供能量[7]。在植物组织器官中，PPi主要是在细胞合成RNA、糖类、蛋白质等物质的生理过程中产生的，如果不能够及时将其清除会影响细胞的生命活动，从而对植物的正常生长发育有不良影响[8-10]。到目前为止，已经在拟南芥、马铃薯、烟草、橡胶树等植物中对PPase基因有一定的研究和功能鉴定，在芒果中对于PPase作用机理方面的研究甚少。相关报道可知PPase催化焦磷酸PPi水解为2个无机正磷酸Pi，是蔗糖合成途径中的调控关键节点之一。开展该研究可为后续研究MiPPase基因在芒果果实蔗糖合成的作用机理提供理论依据。本研究从贵妃芒果果实中采用3′RACE和5′RACE方法，克隆得到了一个PPase基因，通过相关生物信息学分析该基因编码的蛋白序列理化性质、结构域及该基因的其他物种的亲缘关系，并进一步构建了PPase基因的过表达载体，成功转入农杆菌，为进一步研究PPase基因在芒果果实中的表达机制提供了依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  植物材料  本实验从贵妃芒果采集果肉作为原材料。贵妃芒果是由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所儋州芒果种质圃提供。

1.1.2  試剂  Primer STAR MAX高保真酶、rTaq酶（TaKaRa公司）;pEASY-blunt克隆载体、大肠杆菌 DH5α感受态、RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、TransScript? -Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒、T4连接酶（北京全式金公司）;SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit（clontech公司）;农杆菌EH105菌株由本实验保存;引物由天一辉远公司合成。

1.2  方法

1.2.1  贵妃芒果果实总RNA提取及cDNA获取  本实验采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取贵妃芒果果肉总RNA，提取方法参照试剂盒说明书。cDNA获取方法参见TransScript? -Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒操作说明书。

1.2.2  MiPPase基因全长的获取  采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）试剂盒以贵妃芒果果实总RNA为模板合成目的基因MiPPase的第一链的cDNA序列，然后分别扩增MiPPase的3′端和5′端序列，连接到pMD-19T克隆载体上，转化到DH5α大肠杆菌感受态，挑取阳性菌落送测序，根据测序结果拼接目的基因的cDNA全长，再设计含有酶切位点的特异引物（表1）扩增获得MiPPase基因的cDNA全长序列。

1.2.3  MiPPase基因生物信息学分析  使用NCBI上的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html）查找MiPPase基因的开放阅读框并推测其氨基酸序列。利用ExPASY中的ProtParam在线分析工具（http：//www.expasy.org/ tool/protparam.html）分析MiPPase蛋白序列理化性质。使用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）中的Conserved domains 在线分析MiPPase蛋白序列的保守结构域。利用DNAMAN6.0软件预测MiPPase蛋白的结构组成及构建系统发育树。

1.2.4  MiPPase基因表达载体的构建  构建含目的基因的克隆载体pEASYblunt-MiPPase，提取pEASYblunt-MiPPase质粒，使用限制性内切酶Xbal I和Kpn I分别双酶切pEASYblunt-MiPPase质粒和pGreenII 62-SK空表达载体，切胶并利用胶回收试剂盒回收所需片段。使用T4连接酶将胶回收的2个片段连接起来，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。利用Plasmid Mini KitⅠ试剂盒（OMEGA 公司）提取pGreenII 62-SK-MiPPase质粒，使用相同酶进行双酶切鉴定正确后并转入EH105农杆菌感受态细胞，菌液PCR检测，挑取阳性菌液按体积1∶1比例加入50 %甘油，于?80 ℃保存。

2  结果与分析

2.1  贵妃芒果果实总RNA提取

本研究提取贵妃芒果的果实总RNA，经核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，OD260/280的比值在1.9～2.0之间，浓度为200～500 ng/μL，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA，结果显示RNA完整性较好（图1），可用于后续实验。

2.2  芒果PPase基因全长的获取

根据已经报道的PPase基因的序列设计引物，利用RACE方法分别获得MiPPase的5′端序列和3′端序列，将其拼接后获得MiPPase的cDNA全長，重新设计含有Xbal I和Kpn I酶切位点的引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测获得目的条带约1000 bp（图2），连接克隆载体送测序，测序

2.3  MiPPase基因生物信息学分析

2.3.1  MiPPase基因序列分析  贵妃芒中克隆到的PPase基因全长cDNA序列为1014 bp，开放阅读框为837 bp，编码278个氨基酸，相对分子量为30.85 ku，预测其等电点为4.68。利用ExPASy在线软件中的ProtParam分析MiPPase蛋白的理化性质。该蛋白不稳定系数为37.67，较稳定，疏水性GRAVY（grand average of hydropathicity）值为?0.074，说明该蛋白为亲水性蛋白。根据软件分析获得该蛋白氨基酸组成及含量，并做柱状图3A。由图3A可知构成MiPPase蛋白的氨基酸中Ile和Leu含量较高，推测可能与该蛋白的空间结构维持有关。采用Kyte & Doolittle标度，Window Size=13时计算，得到MiPPase蛋白的亲疏水性信号图（图3B），图中显示峰值分布在?0.5 以下的比分布在0.5 以上的多，再次证明该蛋白为亲水性蛋白。

2.3.2  MiPPase蛋白结构域分析及结构预测  在NCBI上运用Blastp比对，发现MiPPase蛋白含有一个Put-Phosphatase（Putative Phosphatase）结构域（图4）。运用 DNAMAN6.0在线分析软件Prabi预测MiPPase 蛋白质的二级结构，发现 α-螺旋（Alpha helix）和无规则卷曲（Random coil）为其主要的结构原件，占据比例分别为41.01%和38.13%。

2.3.3  MiPPase蛋白亲缘进化关系分析  根据MiPPase基因编码序列分析蛋白序列，在NCBI上利用BlastP搜索并下载该基因同源序列，利用MEGA6.0中ClustX多序列比对，邻位相连法构建系统发育树（图5）。结果显示，MiPPase蛋白与红花烟草的PPase蛋白亲缘关系较近。

2.4  MiPPase基因表达载体的构建

使用限制性内切酶Xbal I和Kpn I分别双酶切pEASYblunt-MiPPase质粒和pGreenII 62-SK空表达载体，用T4连接酶连接双酶切后的目的基因和空表达载体，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。使用相同限制酶对pGreenII 62-SK-MiPPase表达载体进行双酶切检测验证（图6A），说明该基因表达载体构建完成。将pGreenII 62-SK-MiPPase

3  讨论

无机焦磷酸酶（PPase）既是H+转运酶[11]，也能催化焦磷酸（PPi）水解为2个无机正磷酸（Pi），是蔗糖合成途径中关键的节点。可溶性的PPase可为植物细胞的生物合成反应提供能源，促进植物生长和发育。一些生物体有膜结合的PPase，这些PPase能够为生物体提供PPi中磷酸酐键的能量，以此来完成跨膜的离子梯度，起质子泵的作用。除此之外，膜结合焦磷酸酶（V-PPase）还具有调节细胞质pH、保存生物能源、转换Pi-PPi、响应逆境胁迫等作用[12-14]。有相关研究报道已从拟南芥、大麦、水稻等多种植物中克隆得到H+-PPase基因，并进行了深入研究[15-16]。与植物 H+-PPase 相比，关于 sPPase的研究进展相对缓慢，主要还集中在对分离基因、基因结构、亚细胞定位等方面的研究，对基因的表达分析及转基因功能鉴定研究较少。

1962年Kunite[17]首次从酵母中分离纯化到PPase。随后，20世纪80年代Lahti等[18]从大肠杆菌中克隆获得PPase的部分基因序列。Visser等[19]1998年从大麦中克隆分离到一个PPase基因，该基因在大麦根、胚乳、嫩芽等代谢器官中均有大量表达。George等[3]沉默烟草PPase基因的表达后，PPi累积量增加，伴随着叶绿素、淀粉的含量减少，进而降低了烟草光合作用的强度。

叶片光合作用产物主要以蔗糖形式，经韧皮部运输到果实内，经过一系列酶的催化及代谢过程，最终以果糖、蔗糖等形式存在于果实中。因此，果实品质主要由糖积累决定。果实主要在液泡中积累糖分，光合作用产物从韧皮部运输到果实内储存必须穿过质膜和液泡膜，而该过程是需要消耗能量的。H+-ATPase和H+-PPase分别水解ATP和PPi来为光合产物运输提供能量[20]，转运物质量越多，H+-ATPase越丰富，活性也越强。章英才等[21]探究得出灵武长枣果实的生长曲线为“双S”型，呈现慢-快-慢-快-慢的生长趋势，在2个快速生长的发育阶段，质膜H+-ATPase活性均较强，糖分跨质膜运输能力也随之较强。李明等[22]发现苹果PPase基因是影响苹果酸积累的关键基因，且高酸果实中PPi的转录量变化趋势与苹果酸积累量变化一致。在植物的细胞质和质体中，PPi也联系蔗糖降解、淀粉合成以及淀粉贮藏器官中糖酵解代谢的纽带。PPi水平的高低将细胞中的合成反应和质体中的分解反应有机协调，从而在蔗糖-淀粉的转换中起到重要的调节作用。成熟的芒果果实风味独特，其果实的甜味主要来源果糖、蔗糖等物质。在芒果未成熟时，其果实的淀粉含量较高，随着果实的发育，淀粉逐渐减少，蔗糖含量升高。不同芒果品种蔗糖含量有一定的差异，从而表现在品质、风味的差异。例如，象牙白品种，其果肉较淡。这些差异可以与PPase基因的表达有一定的关系。本研究从贵妃芒果果实中成功克隆获得一个PPase基因，对其编码的蛋白序列进行分析，并进一步构建了过表达载体，为人工调控芒果果实蔗糖含量奠定基础，为PPase基因在芒果蔗糖代谢中的调控作用提供一定的理论依据。

參考文献

Ferjani A， Segami S， Horiguchi G， et al. Keep an eye on PPi： the vacuolar-type H+-pyrophosphatase regulates postgermina-tive development in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2011， 23（8）： 2895-2908.

Saha S， Mina B L， Gopinath K A， et al. Relative changes in phosphatase activities as influenced by source and application rate of organic composts in field crops[J]. Bioresource Technology， 2008， 99（6）： 1750-1757.

George G M， Merwe M J V D， Nunes-Nesi A， et al. Virus- induced gene silencing of plastidial soluble inorganic pyrophosphatase impairs essential leaf anabolic pathways and reduces drought stress tolerance in Nicotiana benthamiana[J]. Plant Physiology， 2010， 154（1）： 55-56.

Soongyu K， Yiyuong L F， Ruchuan V， et al. Proton pumping inorganic pyrophosphatase of endoplasmic reticulum- enriched vesicles from etiolated mung bean seedlings[J]. Journal of Plant Physiology， 2005， 162（2）： 129-138.

Zeng R， Duan C F， Li X Y， et al. Vacuolar-type inorganic pyrophos-phatase located on the rubber particle in the latex is an essential enzyme in regulation of the rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis[J]. Plant Science， 2009， 176（5）： 602-607.

Zhang J， Li J， Wang X， et al. OVP1， a vacuolar H+- translocating inorganic pyrophosphatase （V-PPase）， overexpression improved rice cold tolerance[J]. Plant Physiology & Biochemistry， 2011， 49（1）： 33-38.

May A， Berger S， Hertel T， et al. The Arabidopsis thaliana phosphate starvation responsive gene AtPPsPase1 encodes a novel type of inorganic pyrophosphatase[J]. BBA - General Subjects， 2011， 1810（2）： 178-185.

Pace D A， Fang J， Cintron R， et al. Overexpression of a cytosolic pyrophosphatase （TgPPase） reveals a regulatory role of PP（i） in glycolysis for Toxoplasma gondii[J]. Biochemical Journal， 2011， 440（2）： 229-240.

Gómezgarcía M R， Losada M， Serrano A. Comparative biochemical and functional studies of family I soluble inorganic pyrophosphatases from photosynthetic bacteria[J]. Febs Journal， 2007， 274（15）： 3948-3959.

Hernández-Domíguez E E， Valencia-Turcotte L G， Rodríguez- Sotres R. Changes in expression of soluble inorganic pyrophosphatases of Phaseolus vulgaris under phosphate starvation[J]. Plant Science， 2012， 187（4）： 39-48.

Wang C S， Jiang Q T， Jian M A， et al. Characterization and expression analyses of the H+-pyrophosphatase gene in rye[J]. Journal of Genetics， 2016， 95（3）： 565-572.

Zhang M， Fang Y， Liang Z， et al. Enhanced expression of vacuolar H+-ATPase subunit E in the roots is associated with the adaptation of Broussonetia papyriferato salt stress[J]. Plos One， 2012， 7（10）： e48183.

Nordbo E， Luoto H H， Baykov A A ， et al. Two independent evolutionary routes to Na+/H+ co-transport function in membrane pyrophosphatases[J]. Biochemical Journal， 2016， 473（19）： 3099-3111.

Yoon H S， Kim S Y， Kim I S. Stress response of plant H+-PPase-expressing transgenic Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae： a potentially useful mechanism for the development of stress-tolerant organisms[J]. Journal of Applied Genetics， 2013， 54（1）： 129-133.

Gaxiola R A， Li J， Undurraga S， et al. Drought-and salt -tolerant plants result from overexpression of the AVP1 H+-pump [J]. Proceedings of the National Academy of Sciencens of the United States of America， 2001， 98（20）： 11444-11449.

Brini F， Gaxiola R G， Masmoudi K. Cloning and characterization of a wheat vacuolar cation / proton antiporter and pyrophosphatase proton pump[J]. Plant Physiology & Biochemistry， 2005， 43（4）： 347-354.

Kunite M. Kunitz M. Hydrolysis of adenosine triphosphate by crystalline yeast pyrophosphatase. Effect of zinc and magnesium ions[J]. Journal of General Physiology， 1962， 45（4）： 31-46.

Lahti R， Pitk?ranta T， Valve E， et al. Cloning and characterization of the gene encoding inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli K-12[J]. Journal of Bacteriology， 1988， 170（12）： 5901-5907.

Visser K， Heimovaara-Dijkstra S， Kijne J W， et al. Molecular cloning and characterization of an inorganic pyrophosphatase from barley[J]. Plant Molecular Biology， 1998， 37（1）： 131-140.

劉  昂， 吴文卫， 赵  磊， 等. 氯化镁预处理对美人蕉根部质膜 H+-ATPase 活性与农田废水硝态氮吸收效率的影响[J]. 西北植物学报， 2014， 34（1）： 128-134.

章英才， 陈亚萍， 景红霞， 等.‘灵武长枣果实糖积累与蔗糖代谢相关酶的关系[J]. 果树学报， 2014， 31（2）： 250-257.

李  明. 苹果果实中苹果酸代谢关键酶基因的克隆和表达分析[D]. 泰安： 山东农业大学， 2007.